一种抑制猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的lncRNA及其应用

一种抑制猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的lncrna及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学中lncrna功能探究技术研发领域，涉及一种抑制猪卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡的lncrna及其应用。


背景技术：

2.众所周知，卵泡的正常发育和排卵对于维持雌性哺乳动物繁殖过程至关重要，而卵泡闭锁作为雌性哺乳动物卵巢组织中一种普遍的生理现象，不仅降低了原始卵泡库的利用率，造成生物资源的浪费，同时严重制约了雌性哺乳动物繁殖力的发挥。因此，探究卵泡闭锁的分子机制对于减少卵泡闭锁、提高排卵率以及维持雌性动物正常的繁殖过程具有重大意义。目前，研究发现颗粒细胞凋亡或程序性死亡是雌性哺乳动物卵泡闭锁的主要诱因，而前者主要受到一个由体内、外多因素组成的复杂网络调控。近期，相关研究表明长链非编码rnas(long non-coding rnas,lncrnas)作为一类重要的表观遗传因子在上述过程中发挥重要作用。
3.lncrnas是一类长度大于200nt、缺乏开放阅读框或编码蛋白能力的内源性rna分子。特征分析发现lncrnas的表达丰度较低、进化保守性与稳定性较差、且具有严格的组织表达模式，上述特点也成为了lncrnas研究过程中的难点。根据目前已发表的高通量测序研究表明lncrnas在卵巢组织中广泛表达，然而仅有极少数的lncrnas经过系统的研究并具有完备的功能注释。近年来，相关研究鉴定了若干与雌性哺乳动物繁殖过程相关的lncrnas，例如lncrna neat1和lncrna h19与雌性小鼠黄体形成息息相关，敲除上述两个lncrnas均可导致黄体缺失、孕酮合成异常、卵巢缺陷，最终导致雌性小鼠不孕不育；另外，linc-01572:28与lncrna malat1被证实可分别通过kip1与erk/mapk轴调控人和小鼠卵巢颗粒细胞增殖水平。上述研究表明lncrnas在雌性卵巢组织中发挥重要作用，但目前lncrnas对雌性哺乳动物卵巢功能和繁殖过程的影响程度尚不清楚，尤其是对猪等大型家畜卵泡发育、卵巢颗粒细胞状态与功能的调控及机制有待进一步研究。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种抑制猪卵泡闭锁与卵巢颗粒细胞凋亡的lncrna及其应用；本发明提供的lncrna norfa的表达水平在猪卵泡闭锁过程中显著下调，lncrna norfa具有抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡，促进卵母细胞体外培养成熟的功能。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
6.本发明提供了一种抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡的lncrna norfa核苷酸全序列，序列长度为739nt，如seq id no.1所示。
7.本发明提供了扩增所述抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡的lncrna norfa的引物对，包括核苷酸序列如seq id no.2所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no.3所示的反向引物。
8.本发明提供了所述的lncrna norfa在抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡中的
应用，通过在猪卵巢颗粒细胞中敲入或过表达所述lncrna norfa，提高抗卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡的能力。
9.本发明提供了所述lncrna norfa的靶基因在抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡中的应用，通过在猪卵巢颗粒细胞中敲入或过表达所述lncrna norfa的靶基因，提高抗卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡的能力。
10.所述的靶基因为tgfbr2基因，该tgfbr2基因的序列号为enssscg00025024102。
11.扩增所述tgfbr2基因的引物对包括核苷酸序列如seq id no.4所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no.5所示的反向引物。
12.本发明提供了所述的lncrna norfa在促进体外培养猪卵母细胞成熟能力中的应用，过表达所述的lncrna norfa能够提高猪卵丘-卵母细胞复合体在体外培养过程中卵母细胞的成熟率。
13.本发明提供了所述lncrna norfa的靶基因在促进体外培养猪卵母细胞成熟能力中的应用，过表达所述lncrna norfa的靶基因能够提高猪卵丘-卵母细胞复合体在体外培养过程中卵母细胞的成熟率。
14.优选的，所述应用通过提高猪卵巢颗粒细胞中所述tgfbr2基因的表达水平实现。
15.本发明的有益效果：
16.本发明提供了一种能够抑制猪卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡的lncrna及其应用；本发明提供的lncrna norfa的表达水平在猪卵泡闭锁过程中显著下调，lncrna norfa及其靶基因tgfbr2具有抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡，促进卵母细胞体外培养成熟能力的功能，为促进卵泡发育和提高母猪繁殖力提供技术支持。
附图说明
17.图1为利用race技术扩增获取猪lncrna norfa末端序列；
18.其中，a为猪lncrna norfa 5’末端扩增产物电泳鉴定结果；b为猪lncrna norfa 3’末端扩增产物电泳鉴定结果。
19.图2为lncrna norfa在母猪健康与闭锁卵泡中的表达水平比较。
20.图3为lncrna norfa和靶基因在猪卵泡中表达水平的相关性。
21.图4为lncrna norfa对猪卵巢颗粒细胞中靶基因表达水平的影响；
22.其中，a为过表达lncrna norfa对靶基因tgfbr2表达水平的影响；b为敲低内源性lncrna norfa对靶基因tgfbr2表达水平的影响。
23.图5为过表达lncrna norfa对猪卵巢颗粒细胞凋亡水平的影响；
24.其中，a为过表达lncrna norfa对猪卵巢颗粒细胞凋亡水平的影响；b为敲低内源性lncrna norfa对猪卵巢颗粒细胞凋亡水平的影响。
25.图6为lncrna norfa靶基因tgfbr2对猪卵巢颗粒细胞凋亡水平的影响；
26.其中，a为过表达靶基因tgfbr2对猪卵巢颗粒细胞凋亡水平的影响；b为敲低内源性靶基因tgfbr2对猪卵巢颗粒细胞凋亡水平的影响。
27.图7为过表达lncrna norfa后猪体外培养卵母细胞的成熟率。
28.图8为过表达靶基因tgfbr2后猪体外培养卵母细胞的成熟率。
29.图9为干扰靶基因tgfbr2对lncrna norfa抗颗粒细胞凋亡和促卵母细胞成熟功能
的影响；
30.其中，a为敲低靶基因tgfbr2对lncrna norfa抗颗粒细胞凋亡能力的影响；b为敲低靶基因tgfbr2对lncrna norfa促卵母细胞体外成熟能力的影响。
具体实施方式
31.本发明提供了一种抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡的lncrna，同时提供所述lncrna及其靶基因tgfbr2在抗卵巢颗粒细胞凋亡、促体外培养卵母细胞成熟以及提高母猪繁殖力等能力中的应用。在本发明中，所述应用优选的通过促进猪卵巢颗粒细胞中所述tgfbr2基因的表达水平实现。
32.下面结合实例，进一步对本发明进行详细说明。
33.实施例1
34.1、实验材料
35.在江苏省某保种场核心群中随机选取100头健康大白母猪(180日龄，110kg体重)用于采集新鲜卵巢，分离卵泡用于提取卵泡总rna，同时用于猪健康卵巢颗粒细胞的分离与体外培养试验。
36.2、猪卵泡总rna提取与反转录
37.根据卵泡外观(颜色和血管分布)、游离颗粒细胞数量以及卵泡液中e2/p4(雌二醇/孕酮)指数分离健康和闭锁卵泡，随后采用trizol试剂(invitrogen公司)提取并纯化猪卵泡总rna，采用反转录试剂盒(vazyme公司)以上述卵泡总rna为模版合成双链cdna，置于-20℃保存。
38.3、猪lncrna norfa核苷酸序列鉴定
39.采用快速扩增cdna末端(race)技术鉴定猪lncrna norfa的核苷酸全序列，具体操作步骤按照5’/3’试剂盒(takara公司)提供的说明书进行。简要过程如下：
①
以上述猪卵泡总rna为模版制备race-first-ready cdna，根据猪lncrna norfa的部分序列特征设计基因特异性扩增引物(5
’‑
gsp和3
’‑
gsp)进行pcr扩增。引物序列分别为，5
’‑
gsp：5
’‑
gct tca cct gca gca ctg cac cc-3’,3
’‑
gsp：5
’‑
tct gtg ggc gcc tgc atc ag-3’。pcr反应程序为：95℃30sec，72℃3min(5循环)；95℃30sec，70℃30sec，72℃3min(5循环)；95℃30sec，68℃30sec，72℃3min(30循环)。pcr产物在2.0％的琼脂糖凝胶中以120v电压下电泳20min(附图1)，确定目标片段后进行dna回收纯化(tingke公司)，将其连接在pmd-19t载体(tingke公司)上，随后经过转化、涂板、挑取单克隆送上海生工公司测序。测序结果使用dnastar软件进行序列比对和分析。
40.4、引物设计与载体构建
41.根据race获得的猪lncrna norfa核苷酸全序列(如seq id no.1所示)，利用primer5.0软件设计1对正反向引物扩增所述基因的全序列，正向引物序列为5
’‑
cat cag cct ccc tgc ctc-3’(seq id no.2)，反向引物序列为5
’‑
aca caa gct cca tga act tgg a-3’(seq id no.3)；另外，根据靶基因tgfbr2基因组序列(genbank id:xm_021071493.1)，利用primer5.0软件设计1对正反向引物扩增猪tgfbr2基因的全序列，正向引物序列为5
’‑
aca tct ggc cgc acc gct-3’(seq id no.4)，反向引物序列为5
’‑
gtg cta aca cag ctt atc cta tg-3’(seq id no.5)。引物有上海生工生物科技有限公司合成。
fitc/pi试剂盒(vazyme公司)对体外培养的猪卵巢颗粒细胞凋亡水平进行检测，结果发现过表达lncrna norfa可显著降低体外培养的猪卵巢颗粒细胞凋亡率(p《0.01)，而敲低lncrna norfa则出现相反的结果(p《0.01)(附图5)；过表达tgfbr2可显著降低体外培养的猪卵巢颗粒细胞凋亡率(p《0.05)，而敲低tgfbr2则出现相反的结果(p《0.01)(附图6)。
49.以第一极体排出率为标准检测lncrna norfa及其靶基因对体外培养卵丘-卵母细胞复合体中卵母细胞成熟率的影响，结果发现过表达lncrna norfa可显著提高猪卵母细胞体外成熟率，而敲低lncrna norfa则出现相反的结果(p《0.01)(附图7)；过表达tgfbr2可显著提高猪卵母细胞体外成熟率，而敲低tgfbr2则出现相反的结果(p《0.01)(附图8)。另外，结果还发现敲低tgfbr2可显著抑制lncrna norfa的抗卵巢颗粒细胞凋亡和促卵母细胞体外培养成熟率的功效(p《0.01)(附图9)。
50.卵巢颗粒细胞凋亡介导的卵泡闭锁是母猪繁殖力的主要抑制因素之一。本发明所述lncrna norfa及其靶基因tgfbr2具有抑制猪卵泡闭锁、卵巢颗粒细胞凋亡和促进体外培养卵母细胞成熟的能力，对促进猪卵泡发育、提高母猪群体的繁殖力具有重要的经济价值，对相关技术和产品的研发提供了一定的理论依据。以上所述仅是本发明的优选实施方案，应当指出在不脱离本发明原理的前提下，本领域技术人员可适当做出改进和调整，但相关调整应视为本发明的保护范围。
51.序列表
52.seq id no.1
[0053][0054]
seq id no.2
[0055]
catcagcctc cctgcctc
[0056]
seq id no.3
[0057]
acacaagctc catgaacttg ga
[0058]
seq id no.4
[0059]
acatctggcc gcaccgct
[0060]
seq id no.5
[0061]
gtgctaacac agcttatcct atg
[0062]
seq id no.6
[0063]
aggaacctgcgtgggaatc
[0064]
seq id no.7
[0065]
ccgatctccc agcatgaaa
[0066]
seq id no.8
[0067]
gtgcccaagc aggtcattca
[0068]
seq id no.9
[0069]
ctcctcaggg cttcggtca
[0070]
seq id no.10
[0071]
gatggtgaag gtcggagtg
[0072]
seq id no.11
[0073]
cgaagttgtc atggatgacc
[0074]
seq id no.12
[0075]
cagacagaug uggaugaaut t
[0076]
seq id no.13
[0077]
auucauccac aucugucugt t
[0078]
seq id no.14
[0079]
gccaacaaca ucaaccacat t
[0080]
seq id no.15
[0081]
ugugguugau guuguuggct t
[0082]
seq id no.16
[0083]
uucuccgaac gugucacgut t
[0084]
seq id no.17
[0085]
acgugacacg uucggagaat t