牛支原体组合物

牛支原体组合物
1.本技术是分案申请，其对应的母案申请是于2016年8月11日提交的申请号为 201680047885.8的发明专利申请，其发明名称为“牛支原体组合物”。
技术领域
2.本发明涉及牛支原体免疫原性组合物。本发明进一步涉及用于引起动物对牛支原体的免疫反应的免疫原性组合物，和用于产生对抗由牛支原体引起的哺乳动物感染的保护性反应的方法。


背景技术：

3.牛支原体在全世界的牛群中引起多种疾病，所述疾病包括例如乳腺炎、肺炎、关节炎、耳炎、皮肤脓肿、不孕症、流产或其组合。在每种形式的疾病中，可出现死亡。由此牛支原体受到世界范围的乳制品和牛肉生产者以及兽医的明显关注。已开发和提议各种抗生素作为降低通过这种病原体产生的经济损失和死亡率的工具。通过应用安全且有效的疫苗预防疾病通过加强动物福利、改进生产者经济因素以及支持审慎使用抗生素来向抗生素疗法提供明显优势。已开发含有灭活(例如，杀死的)牛支原体的疫苗。然而，杀死的疫苗通常在保护性反应开始时存在长时间延迟，可能需要多于一个剂量，且在一些情况下，可能需要在某些应用中不合适的佐剂。
4.减毒活或经修饰的活疫苗是有利的，原因在于所述疫苗可引起更快速免疫反应的发展，当以单一剂量施用时常常是有效的，且一般来说对生产而言更便宜。因此，需要改进牛支原体疫苗，包括减毒活疫苗。


技术实现要素：

5.申请人已出人意料地鉴别出适用于产生对哺乳动物牛支原体感染的保护性免疫反应的免疫原性组合物。所述组合物可另外与佐剂组合。所述组合物也可与额外抗原组合，产生用于对抗哺乳动物中的多种感染的多价组合物。
6.本发明的一个实施例提供免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含减毒的牛支原体(mycoplasma bovis)菌株，其中所述菌株以寄存编号pta-122167寄存于美国典型培养物保藏中心(american type culture collection，atcc)，分类命名为牛支原体 (mycoplasma bovis)n2805-1 k-uc1004。
7.另一实施例提供免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含化学减毒的牛支原体菌株，所述菌株相比于亲本菌株具有蛋白硝基还原酶、组氨酸磷酸酶、切除核酸酶abc 亚基b、dna聚合酶iii亚基β和atp合成酶f1亚基δ中的一种或多种中的一个或多个突变。
8.另一实施例提供免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含牛支原体菌株，其中所述菌株是pta-122167，另外其中所述菌株已逆向工程改造成在根据牛支原体菌株 hubei-1的参考基因组的核苷酸编号的以下位置处含有在参考牛支原体菌株3683 #22/3/12中找到的原始核苷酸中的任一种中的一个或多个：115273、194478、194484、 194525、
194724、204966、207629、262327、271487、271661、271666、272086、272133、 309463、310075、310078、310086、310090、311988、334184、358013、365101、365188、 397010、397901、399129、410247、410253、410334、410514、410733、414666、453388、 468457、502577、502678、502963、543859、560986、632309、632366、632612、633994、 686074、687874、687915、696348、729874、730046、761587、761663、761810、761815、 765176、765328和其765403。
9.另一实施例提供免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含先前实施例的减毒的牛支原体菌株，其中所述牛支原体菌株是灭活的。
10.另一实施例提供先前实施例中的任一项的免疫原性组合物，且另外提供佐剂。
11.另一实施例提供先前实施例中的任一项的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物进一步包含至少一种额外抗原。
12.另一实施例提供先前实施例的免疫原性组合物，其中额外抗原选自由以下组成的组：病毒、细菌、真菌和寄生虫。
13.另一实施例提供先前实施例中的任一项的免疫原性组合物，其中所述组合物调配成用于通过选自由以下组成的组的途径施用：肌肉内、皮下、鼻内、气管内、口服和喷雾。
14.另一实施例提供用于预防由牛科动物的牛支原体引起的疾病的方法，所述方法包含向动物施用免疫量的先前实施例中的任一项的免疫原性组合物。
15.另一实施例提供用于预防由牛科动物的牛支原体和另一感染因子引起的疾病的方法，所述方法包含向动物施用免疫量的先前实施例中的任一项的免疫原性组合物和额外抗原。
16.另一实施例提供减毒的牛支原体菌株或灭活减毒的牛支原体菌株在制造用于预防由牛科动物的牛支原体引起的疾病的药剂中的用途。
17.另一实施例提供牛支原体疫苗，所述疫苗由包含以下的步骤产生：(a)获得以 pta-122167寄存于atcc的牛支原体培养物；(b)使所述牛支原体培养物进一步传代至少一次；(c)从所述传代培养物分离克隆株；以及(d)用载剂或赋形剂和任选佐剂调配所述克隆株。
18.另一实施例提供先前实施例的疫苗，其中从传代培养物获得的克隆株相较于 pta-122167进一步减毒。
19.另一实施例提供得到牛支原体疫苗的方法，其中所述疫苗由包含以下的步骤产生： (a)获得以pta-122167寄存于atcc的牛支原体培养物；(b)使所述牛支原体培养物进一步传代至少一次；(c)从所述传代培养物分离克隆株；以及(d)用载剂或赋形剂和任选佐剂调配所述克隆株。
20.另一实施例提供诱变处理牛支原体亲本菌株的方法，其中所述方法包含使所述菌株经受化学诱变，随后选择在活体外连续传代之后仍然有活性的后代菌株。
21.另一实施例提供诱变处理牛支原体亲本菌株的方法，其中亲本菌株是牛支原体菌株 3683。
22.另一实施例提供诱变处理牛支原体亲本菌株的方法，其中后代菌株以寄存编号 pta-122167寄存于美国典型培养物保藏中心。
23.另一实施例提供诱变处理牛支原体亲本菌株的方法，其中所述方法包含使所述菌
株经受化学诱变，随后选择在活体外连续传代之后仍然有活性的后代菌株，其中后代菌株在根据牛支原体菌株hubei-1的参考基因组的核苷酸编号的以下位置处含有原始核苷酸中的任一种中的一个或多个：115273、194478、194484、194525、194724、204966、207629、 262327、271487、271661、271666、272086、272133、309463、310075、310078、310086、 310090、311988、334184、358013、365101、365188、397010、397901、399129、410247、 410253、410334、410514、410733、414666、453388、468457、502577、502678、502963、 543859、560986、632309、632366、632612、633994、686074、687874、687915、696348、 729874、730046、761587、761663、761810、761815、765176、765328和765403。
附图说明
24.图1提供野生型牛支原体菌株3683、牛支原体温度敏感突变体#22/3/12和牛支原体突变体n2805-1在33℃和38℃下的生长速率的对比。
具体实施方式
25.本文中提及的所有公开、专利申请、专利和其它参考文献都以全文引用的方式并入。
26.除非本文中另外定义，否则结合本发明实施例使用的科学与技术术语将具有所属领域的普通技术人员通常理解的含义。另外，除非上下文另外需要，否则单数术语将包括复数，并且复数术语将包括单数。
27.如本文中所使用，术语“佐剂”意指修饰其它试剂的效应的药理学或免疫试剂，所述其它试剂如药物或免疫原性组合物。佐剂常常包括于免疫原性组合物中以增强接受者对所供应抗原的免疫反应。佐剂的进一步描述参看下文。
28.如本文中所使用，术语“抗体(antibody/antibodies)”意指能够借助于识别表位来结合到抗原的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白是由具有“恒定”区和“可变”区的“轻”和“重”多肽链构成的血清蛋白，并且基于恒定区的组成而分成多类(例如，iga、igd、ige、igg 以及igm)。抗体对给定抗原具有“特异性”指示抗体的可变区排他性地识别并结合特定抗原。抗体可以是多克隆混合物或单克隆抗体。所述抗体可以是来源于天然或重组来源的完整免疫球蛋白，或可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。抗体可以各种形式存在，所述形式包括fv、fab'、f(ab')2、fc以及单链。抗体可转化成抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包括但不限于抗体片段。如本文中所使用，可互换使用的术语“抗原结合蛋白”、“抗体”和类似术语是指一种或多种多肽或其一个或多个片段，所述片段包含抗原结合位点。术语“抗原结合蛋白”或“抗体”优选地是指单克隆抗体和其片段，以及其可结合到特定蛋白质和其片段的免疫结合等效物。如本文中所使用，术语不仅涵盖完整多克隆或单克隆抗体，还涵盖其片段。出于本发明的目的，除非另外说明，否则“抗体”和“抗原结合蛋白”还包括抗体片段。示范性抗体片段包括都被所属领域的技术人员识别为是抗原结合蛋白或抗体片段的fab、fab'、f(ab')2、fv、scfv、fd、dab、双功能抗体、其抗原识别片段、小模块化免疫药物(smip)纳米抗体和类似物，和上文提及的片段及其化学或基因操控的对应物中的任一种，以及其它抗体片段和其突变体、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰的构型。抗体和抗原结合蛋白可经由例如传统融合瘤技术(kohler等人，《自然
(nature)》256:495-499(1975))、重组dna方法(美国专利第4,816,567号)或使用抗体文库的噬菌体呈现技术(clackson 等人，《自然(nature)》352:624-628(1991)；marks等人，《分子生物学杂志(j.mol. biol)》222:581-597(1991))来制得。关于各种其它产生抗体的技术，参看《抗体：实验室手册(antibodies:a laboratory manual)》，harlow等人编，冷泉港实验室(cold springharbor laboratory)，1988，以及所属领域的技术人员熟知的其它技术。
29.如本文中所使用，“抗原”意指含有一个或多个在暴露于受试者后将诱发对所述抗原具有特异性的免疫反应的表位(线性、构形或这两种)的分子。表位是结合到t细胞受体或特异性b细胞抗体的抗原的特异性位点，并且通常包含约3个到约20个氨基酸残基。术语“抗原”还可指亚基抗原，从自然界中抗原相关的完整生物体中分离和分散的抗原；以及杀死、减毒或灭活的细菌、病毒、真菌、寄生虫或其它微生物。术语“抗原”还指抗体，如抗个体基因型抗体或其片段；以及可模拟抗原或抗原决定子(表位)的合成肽模拟表位。术语“抗原”还指在活体内，如在dna免疫接种应用中表达抗原或抗原决定子的寡核苷酸或多核苷酸。如本文中所使用，“抗原”是能够由抗体或抗原结合蛋白特异性地结合的分子或分子的一部分。具体地说，抗体或抗原结合蛋白将结合到抗原的表位。如本文中所使用，表位是指由抗体或抗原结合蛋白的可变区的高变区或互补决定区 (cdr)识别的抗原决定子。
30.如本文中所使用，术语“动物”意指家养和野生的易受牛支原体感染的任何动物。优选地，如本文中所使用，“动物”是指牛。
31.如本文中所使用，术语“减毒的”是指微生物菌株，所述微生物菌株的致病性已减少以使得菌株一般来说将引发免疫反应但不产生疾病。减毒的菌株相较于衍生所述菌株的亲本菌株毒性较小。减毒的微生物可在活体外或活体内筛查以确认所述微生物相较于它的亲本菌株致病性较低。常规手段用于引入减毒突变体，所述手段如活体外传代以及化学突变诱发。减毒的替代手段包含使用可引入一个或多个突变的定点突变诱发来产生预定突变体。如本文中所使用，术语“进一步减毒的”是指除衍生出菌株的减毒的菌株以外已进一步经修饰的菌株。这种进一步减毒可通过额外活体外传代或额外的多次化学或定点突变诱发达成。为用作活疫苗，任何减毒的生物体必须仍然使得宿主免疫系统引发有效免疫反应，这可能需要所述生物体的一定生长。
32.如本文中所使用，术语“细菌(bacteria)”、“细菌物种”、“细菌(bacterium)”和类似术语意指较大范围的原核微生物。
33.如本文中所使用，术语“牛”意指一组不同的中等尺寸到较大尺寸的有蹄动物，所述有蹄动物一般来说具有偶蹄且至少一个性别的动物具有真正的角。牛包括但不限于家牛、野牛、非洲水牛、水牛、牦牛和四角羚羊或螺旋角羚羊。
34.如本文中所使用，术语“化学突变诱发”意指使用化合物来提高一些类型的突变在自然背景水平上出现的频率。所使用的化合物在浓度方面可不同，这是因为所述化合物在以下方面可不同：进入细胞的能力、与核酸的反应性程度、全身毒性以及所述化合物引入到核酸中的化学变化类型将由内源性修复系统修正的概率。
35.如本文中所使用，术语“免疫原性组合物”或“免疫量”意指当向动物单独施用或与药学上可接受的载剂一起施用时引发有效免疫反应(即，具有有效和/或至少部分保护的免疫原性活性)的组合物。免疫反应可以是主要由细胞毒素t细胞介导的细胞免疫反应或主要
由辅助t细胞介导的体液免疫反应，所述辅助t细胞随后活化b细胞使得抗体产生。另外，可产生特异性t淋巴细胞或抗体以允许将来保护已免疫的宿主。
36.如本文中所使用，术语“分离”意指将所提及的材料从通常它存在的环境的组分中之一些移除。因此，分离的生物材料可不含一些细胞组分，即存在或产生所述材料的细胞组分。就核酸分子而言，分离的核酸包括例如pcr产物、分离的mrna、cdna或限制片段。在另一实施例中，分离的核酸优选地从它可能存在的染色体切离，并且更优选地不再接合到非调节、非编码区或当在染色体中存在时不再接合到定位在核酸分子上游或下游的其它基因。在又一实施例中，分离的核酸不含一个或多个内含子。分离的核酸分子包括插入到质体、粘质体、人工染色体和类似物中的序列。因此，在一特定实施例中，重组核酸是分离的核酸。分离的蛋白质可与其它蛋白质或核酸或这两种相关，与所述分离的蛋白质在细胞中相关的相关，或如果所述分离的蛋白质为膜相关蛋白，那么与细胞膜相关。分离的细胞器、细胞或组织从生物体中存在所述分离的细胞器、细胞或组织的解剖位点移除。可纯化但并非必须纯化分离的材料。“分离”或“纯化”的多肽或多核苷酸，例如“分离的多肽”或“分离的多核苷酸”，纯化到超出它在自然界存在的状态。举例来说，“分离”或“纯化”的多肽或多核苷酸可大体上不含细胞材料或者来自衍生出蛋白质或多核苷酸的多肽或组织来源的其它污染性蛋白质，或在化学合成时大体上不含化学前体或其它化学物质。制备具有不到约50％的非抗原结合蛋白(在本文中也称作“污染性蛋白质”) 或化学前体的抗原结合蛋白视为“大体上不含”所述非抗原结合蛋白或化学前体。40％、 30％、20％、10％且更优选地5％(按干重计)的非抗原结合蛋白或化学前体视为大体上不含所述非抗原结合蛋白或化学前驱体。
37.如本文中所使用，术语“药剂”意指促进从感染、损伤或病痛恢复的试剂；药物。
38.如本文中所使用，术语“突变体”意指引起突变情况或由突变情况产生的个体或生物体，所述突变情况是生物体的核酸或染色体内的碱基对序列变化，且使得产生野生型个体或生物体中不存在的特征或特点。
39.如本文中所使用，术语“亲本”或“亲本菌株”意指衍生子代或后代的实体。如本文中所使用，术语“后代”意指由一个或多个亲本或亲本菌株产生或来源于一个或多个亲本或亲本菌株。
40.如本文中所使用，术语“预防(prevent/preventing/prevention)”和类似术语意指抑制微生物的复制、抑制微生物的传播或抑制微生物在它的宿主中产生。这些术语和类似术语也可意指抑制或阻断感染的一种或多种病征或症状。
41.如本文中所使用，术语“逆向工程改造”或“逆向诱变处理”意指通过基因手段(例如，聚合酶链反应或pcr)再引入原始核苷酸序列，所述原始核苷酸序列出现在微生物的基因组内的一个或多个特定位置处，其中先前已改变了那个序列。
42.如本文中所使用，术语“连续传代(serial passage/serial passaging)”意指用于纯化生物体，优选地微生物，以获得克隆的纯净种群的方法。术语还可指用于减毒或减弱生物体的毒性的技术，所述生物体优选地为微生物。
43.如本文中所使用，术语“治疗有效量”(或“有效量”)意指当向个体或患者施用时，按需要在存在或不存在佐剂的情况下按需要以单一或多剂量提供的足以影响有益或所要的结果的活性成分的量，所述活性成分例如根据本发明的试剂。有效量可以一次或多次给药、施加或剂量来施用。根据本发明的治疗有效量的组合物可易于由所属领域的普通技术
人员确定，且向患者提供可测量的益处，如保护动物免受类似病原体的后续攻击。
44.如本文中所使用，术语“治疗(therapeutic/treatment)”涵盖治疗疾病或失调症的全部抗菌谱。借助于实例，本发明的“治疗”试剂可以一种方式起作用，或治疗可产生防治性或预防性效应，所述治疗包括并入设计成靶向可标识为处于风险中的动物的程序的那些治疗(药物遗传学)；或以在本质上是改善性或治愈性的方式起作用；或可用以使正治疗的疾病或失调症的至少一种症状的发展速率或程度变慢。
45.如本文中所使用，术语“兽医学上可接受的载剂”是指在合理医学判断的范围内适用于与动物组织接触而无不当毒性、刺激、过敏反应等等，与合理的效益-风险比率相称，并且对所述载剂预期用途有效的物质。
46.提供以下描述来帮助所属领域的技术人员实践本发明。即使如此，本说明书不应理解为不恰当地限制本发明，因为在不脱离本发明发现的精神或范围的情况下本文中所论述的实施例中的修改和变化可由所属领域的普通技术人员作出。
47.细菌；免疫原性组合物
48.在本发明的某些实施例中，已减毒以及表征了来自牛的牛支原体菌株。所述牛支原体菌株的分离株在2015年5月12日寄存于美国典型培养物保藏中心(“atcc”，美国弗吉尼亚州马纳萨斯)，且已指定寄存编号pta-122167，其分类命名为牛支原体 (mycoplasma bovis)n2805-1 k-uc1004。
49.本发明的免疫原性组合物可在用于免疫原性组合物中之前减毒或灭活。减毒和灭活的方法是所属领域的技术人员熟知的。减毒的方法包括但不限于在细胞培养物中连续传代、紫外线照射和化学突变诱发。大量化学诱变剂可直接地与dna相互作用。然而，许多化学物质，如芳族胺和苯，自身并非一定突变诱发，但通过细胞中的代谢过程，所述化学物质产生突变诱发化合物。化学诱变剂也可包括反应性氧物种(ros)。这些反应性氧物种可包括过氧化物、羟基和过氧化氢。大量这些高度反应性物种由正常细胞过程产生，例如作为线粒体电子传递或脂质过氧化的副产物。大量其它化学诱变剂也可产生这些ros。这些ros可使得产生各种碱基加成物以及dna链断裂和交联。化学诱变剂也可包括脱氨基(deaminate)试剂，例如亚硝酸，所述脱氨基试剂可通过将胞嘧啶转化成尿嘧啶来产生过渡突变体。多环芳族烃(pah)也是化学诱变剂。当活化时，所述多环芳族烃可结合到dna且形成加成物。化学诱变剂也可包括烷化剂，如乙基亚硝基脲(ethylnitrosourea)。这些化合物将甲基或乙基转移到碱基或主链磷酸基。当烷基化时，鸟嘌呤可与胸腺嘧啶错配。这些烷化剂中的一些可使得dna交联和断裂。亚硝胺为诱变剂的重要基团，如可在烟草中找到。甲硝基亚硝胍(methylnitronitrosoguanidine) (mnng、mng或ntg)是烷化剂，所述甲硝基亚硝胍通过将烷基添加到鸟嘌呤的o6和胸(腺)嘧啶的o4来起作用，可在gc与at之间产生过渡突变体。这些改变不使得dna 双螺旋严重失真，且由此难以由dna错配修复系统检测。其它烷化剂也可包括芥子气和氯乙烯。
50.灭活的方法包括但不限于使用福马林、β丙内酯(betapropiolactone)(bpl)或二元伸乙亚胺(bei)或所属领域的技术人员已知的其它方法来治疗。由福马林灭活可通过将细菌悬浮液与37％甲醛混合到0.05％的最终甲醛浓度来执行。细菌甲醛混合物在室温下连续搅拌大约24小时。灭活的细菌混合物随后通过检定在培养基中的生长来测试残余活细菌。由bei灭活可通过将细菌悬浮液与0.1m bei(含2-溴-乙胺的0.175n naoh) 混合到1mm
corixa，蒙大拿州汉密尔顿)，所述mpl
tm
描述于美国专利第4,912,094号中，所述专利由此以引用的方式并入。还适用作佐剂的是合成脂质a类似物或胺基烷基葡糖胺磷酸盐化合物(agp)或其衍生物或其类似物，所述脂质a类似物或胺基烷基葡糖胺磷酸盐化合物或其衍生物或其类似物可从corixa(蒙大拿州汉密尔顿)获得，且描述于美国专利第6,113,918号中，所述专利由此以引用的方式并入。一种这类agp是2-[(r)-3-十四酰氧基十四酰氨基]乙基2-脱氧-4-o-膦酰基-3-o-[(r)-3-十四酰氧基十四酰基]-2-[(r)-3-十四酰氧基十四酰基-氨基]-b-d-吡喃葡萄糖苷，也称为529(原名rc529)。这529佐剂调配为水溶液形式或调配为稳定乳液。
[0056]
又其它佐剂包括矿物油和水乳液；铝金属盐(矾)，如氢氧化铝、磷酸铝等；爱菲金(amphigen)；阿夫立定；l121/角鲨烯；d-丙交酯-聚乳酸交酯/糖苷；普朗尼克(pluronic) 多元醇；胞壁酰二肽；杀死的博德特氏菌(bordetella)；皂苷，如stimulontmqs-21 (antigenics，马萨诸塞州弗雷明汉)，描述于美国专利第5,057,540号中，所述专利由此以引用的方式并入，和自其产生的粒子，如iscoms(免疫刺激复合物)；结核分枝杆菌；细菌脂多糖；合成多核苷酸，如含有cpg基元的寡核苷酸(美国专利第6,207,646 号，所述专利由此以引用的方式并入)；百日咳毒素(pt)或大肠杆菌热不稳定毒素(lt)，尤其lt-k63、lt-r72、pt-k9/g129，参看例如国际专利公开第wo 93/13302号和第wo 92/19265号，所述公开以引入的方式并入本文中。
[0057]
还适用作佐剂的为霍乱毒素(ct)和其突变体，包括公开的国际专利申请第wo 00/18434号中所描述的那些霍乱毒素和其突变体(其中氨基酸位置29处的谷氨酸被除天冬氨酸外的另一氨基酸置换，优选地为组氨酸)。类似ct毒素或突变体描述于公开的国际专利申请第wo 02/098368号中(其中氨基酸位置16处的异白氨酸被另一氨基酸单独或与氨基酸位置68处的丝氨酸置换组合地置换；且/或其中氨基酸位置72处的缬氨酸经另一氨基酸置换)。其它ct毒素在公开的国际专利申请第wo 02/098369号中描述(其中氨基酸位置25处的精氨酸经另一氨基酸置换；且/或氨基酸插入在氨基酸位置49处；且/或两种氨基酸插入在氨基酸位置35和36处)。所述ct毒素或突变体可包括于免疫原性组合物中或者作为独立实体或作为用于本发明的神经毒性肽的融合搭配物。
[0058]
本发明的免疫原性组合物也可包括表面活性物质。合适的表面活性物质包括但不限于：醌类似物、十六烷基胺、十八烷基胺、十八基氨基酸酯、溶血卵磷脂、二甲基-双十八烷铵溴化物、甲氧基十六烷基甘油和普朗尼克多元醇；多元胺，例如哌喃、硫酸聚葡萄糖(dextransulfate)、聚ic、卡波莫(carbopol)；肽，例如胞壁酰基肽和二肽，二甲基甘氨酸，促吞噬肽(tuftsin)；油乳液；以及矿物凝胶，例如磷酸铝等，和免疫刺激复合物(iscoms)。
[0059]
所有前述佐剂和额外物质可以易于经受所属领域的技术人员确定的量使用。
[0060]
本发明的免疫原性组合物也可包括抗生素。这类抗生素包括但不限于来自氨基糖苷、碳青霉烯、头胞菌素、糖肽、大环内酯、青霉素、多肽、喹诺酮、磺酰胺以及四环素类别的抗生素。在一个实施例中，本发明涵盖包含约1μg/ml到约60μg/ml抗生素的免疫原性组合物。在另一实施例中，免疫原性组合物包含约5μg/ml到约55μg/ml抗生素，或约10μg/ml到约50μg/ml抗生素，或约15μg/ml到约45μg/ml抗生素，或约20μg/ml 到约40μg/ml抗生素，或约25μg/ml到约35μg/ml抗生素。在又一实施例中，免疫原性组合物包含少于约30μg/ml抗生素。
[0061]
其它添加剂也可包括于本发明的免疫原性组合物中，包括防腐剂、稳定成分和类似添加剂。合适的示范性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、丙三醇、酚和对氯苯酚。可使用的合适的稳定成分包括例如酪蛋白氨基酸、蔗糖、明胶、酚红、n-z胺、磷酸二氢钾、乳糖、乳白蛋白水解产物和奶粉。免疫原性组合物还可并入适用作免疫原性组合物的脂质体中，且还可含有适合于所选择的组合物的给药模式的其它添加剂。组合物可包括其它医药学上可接受的赋形剂供用于产生散剂、液体或悬浮液剂型。参看例如，《雷明顿：医药科学和实践 (remington:the science and practice of pharmacy)》第2卷，第19版(1995)，例如第 95章喷雾剂；以及国际专利公开第wo99/45966号，所述文献的教示由此以引用的方式并入。
[0062]
本发明的免疫原性组合物可包括其它抗原。抗原可呈微生物的灭活的完整或不完整制备物形式，或呈由重组技术或化学合成所获得的抗原分子形式。适合于根据本发明使用的其它抗原包括但不限于来源于病原菌的那些抗原，如睡眠嗜血杆菌(haemophilussomnus)、副猪嗜血杆菌、支气管炎博德特菌、炭疽杆菌、肋膜肺炎放线杆菌 (actinobacillus pleuropneumonie)、出血败血性巴斯德氏菌、溶血性曼氏杆菌(mannhemiahaemolytica)、牛支原体、牛分枝杆菌、牛副结核分枝杆菌(mycobacteriumparatuberculosis)、梭菌属、乳房链球菌(streptococcus uberis)、金黄色酿脓葡萄球菌、猪红斑丹毒丝菌(erysipelothrix rhusopathiae)、衣原体属、布鲁氏菌属、弧菌属、血清型肠道沙门氏菌(salmonella enterica serovars)和钩端螺旋体属。抗原也可来源于：致病性真菌，如假丝酵母；原虫，如微小隐孢子虫、新孢子虫(neospora canium)、刚地弓形虫、艾美尔球虫属、巴倍虫属、贾第鞭毛虫属；或蠕虫，如奥斯特线虫、古柏线虫、血矛线虫属和片吸虫属(fasciola)。额外抗原可包括致病性病毒，如牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛疱疹病毒、牛副流感病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛腺病毒、牛鼻病毒、牛呼肠病毒(bovine reovirus)、牛呼吸道合胞病毒(bovine respiratory syncytial virus)、牛白血病病毒(bovine leukosis virus)、牛瘟病毒(rinderpest virus)、口蹄疫病毒和狂犬病病毒。
[0063]
给药形式、剂量、途径和时序
[0064]
本发明的免疫原性组合物可向动物施用以诱发抗牛支原体的有效免疫反应。因此，本发明提供刺激抗牛支原体的有效免疫反应的方法，其通过向动物施用治疗有效量的本文中所描述的本发明的免疫原性组合物来进行。
[0065]
取决于给药途径，本发明的免疫原性组合物可以各种形式制得。举例来说，免疫原性组合物可以适合于可注射使用的无菌水溶液或分散液形式制得，或使用冷冻干燥技术以冻干形式制得。冻干免疫原性组合物通常保持在约4℃下，且可在稳定溶液中在存在或不存在佐剂的情况下复原，所述稳定溶液例如盐水或hepes。免疫原性组合物也可以悬浮液或乳液形式制得。
[0066]
这些免疫原性组合物可含有适合于通过任何常规给药途径施用的添加剂。本发明的免疫原性组合物可制备用于以例如液体、粉剂、喷雾剂、锭剂、胶囊、肠包衣锭剂或胶囊或栓剂形式向个体施用。因此，免疫原性组合物还可包括但不限于悬浮液、溶液、油性或水性媒剂中的乳液、胶状物和可植入持续释放或生物可降解调配物形式。在用于非经肠给药的调配物的一个实施例中，活性成分以干燥(即粉末或颗粒)形式提供以在非经肠给药复原组合物之前用适合媒剂(例如无菌无热原质水)复原。其它适用的可非经肠给药的调配物包括
包含呈微晶形式、以脂质体制剂或作为生物可降解聚合物系统的组分的活性成分的那些调配物。持续释放或植入的组合物可包括医药学上可接受的聚合或疏水性材料，如乳液、离子交换树脂、微溶性聚合物或微溶性盐。
[0067]
本发明的免疫原性组合物包括治疗有效量的牛支原体。纯化细菌可直接地用于免疫原性组合物，或可进一步减毒或灭活。通常，有效免疫原性组合物含有约1
×
102与约 1
×
10
12
之间的细菌粒子，或约1
×
103与约1
×
10
11
之间的细菌粒子，或约1
×
104与约1
×
10
10
之间的细菌粒子，或约1
×
105与约1
×
109之间的细菌粒子，或优选地约1
×
106与约1
×
108之间的细菌粒子。有效提供保护作用的免疫原性组合物中的细菌的精确量可由所属领域的技术人员确定。
[0068]
有效免疫原性组合物一般以约0.5ml与约5ml之间的体积包含兽医学上可接受的载剂。在另一实施例中，载剂的体积在约1ml与约4ml之间，或在约2ml与约3ml 之间。在另一实施例中，载剂的体积是约1ml，或是约2ml，或是约5ml。适用于免疫原性组合物中的兽医学上可接受的载剂可以是本文中所描述的那些载剂中的任一种。
[0069]
这类载剂包括但不限于水、盐水、缓冲盐水、磷酸盐缓冲液、醇/水溶液、乳液或悬浮液。其它常用的稀释剂、佐剂和赋形剂可根据常规技术添加。这类载剂可包括乙醇、多元醇和其适合混合物、植物油和可注射的有机酯。也可以采用缓冲液和ph值调节剂。缓冲液包括但不限于由有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲液包括但不限于有机酸盐，例如柠檬酸(例如柠檬酸盐)、抗坏血酸、葡萄糖酸、组氨酸-hel、碳酸、酒石酸、丁二酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐；tris、三甲胺盐酸盐或磷酸盐缓冲液。非经肠载剂可包括氯化钠溶液、林格氏(ringer's)右旋糖、右旋糖、海藻糖、蔗糖、乳酸林格氏溶液或不挥发性油。静脉内载剂可包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，如基于林格氏右旋糖和类似非经肠载剂的那些补充剂。例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂(例如edta)、惰性气体和类似物的防腐剂和其它添加剂还可提供于医药载剂中。本发明不受载剂选择的限制。所属领域的技术人员能够从上述组分制备具有适当ph、等张性、稳定性和其它常规特征的这些医药学上可接受的组合物。参见例如，如下文本：《雷明顿：医药科学和实践(remington:the science and practice of pharmacy)》，第20版，利平科特威廉姆斯和维尔金斯出版社(lippincott williams&wilkins)出版，2000；以及《医药赋形剂手册(the handbook of pharmaceutical excipients)》，第4版，r.c.rowe等人编，apha 出版社(apha publications)，2003。
[0070]
所属领域的技术人员可易于确定细菌在给药之前是否需要进行减毒或灭活。在本发明的另一实施例中，牛支原体可在不进行额外减毒的情况下直接向动物施用。治疗有效的细菌的量可视所使用的特定细菌、动物的病症和/或感染程度而定而变化，且可由所属领域的技术人员确定。
[0071]
根据本发明的方法，可以向动物施用单次剂量，可替代地，两次或两次以上接种可以约两周到约十周的时间间隔进行。可能需要强化方案，并且可调节给药方案以提供最佳免疫接种。所属领域的技术人员可易于确定最佳给药方案。当使用多于一次剂量时，第一和第二剂量施用到动物的相同位置不是必须的情况。
[0072]
有效免疫原性组合物可直接地施用到血流中、施用到肌肉中或施用到内部器官中。合适的非经肠给药的手段包括、静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、脑室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌肉内和皮下。合适的非经肠给药的装置包括针(包括微针)注射器、无针注射器和输
液技术。
[0073]
非经肠调配物通常是水溶液，其可含有赋形剂(例如盐)、碳水化合物和缓冲剂(优选地达到ph值为约3到约9，或约4到约8，或约5到约7.5，或约6到约7.5，或约7 到约7.5)，但对于一些应用，所述调配物可更适合地调配为无菌非水溶液或调配为待与合适的媒剂结合使用的干燥形式，所述合适的媒剂如无菌无热原质水。在无菌条件下例如通过冻干来制备非经肠调配物可使用所属领域的技术人员熟知的标准医药技术来容易地实现。
[0074]
用于制备非经肠溶液的化合物的可溶性可通过使用所属领域的技术人员已知的适当调配技术来提高，如并入可溶性增强剂，包括缓冲液、盐、表面活性剂、脂质体、环糊精和类似可溶性增强剂。
[0075]
用于非经肠给药的调配物可调配为立即释放和/或修饰释放的。修饰释放调配物包括延迟、持续、脉冲、控制、靶向和程控的释放。由此，本发明的化合物可调配为固体状的、半固体的或触变的液体以用于作为植入储存物施用，提供活性化合物的修饰释放。这类调配物的实例包括经药物涂布的支架和聚(dl-乳酸-乙醇)酸(plga)微球体。
[0076]
本发明的有效免疫原性组合物也可体表施用到皮肤或黏膜，也就是说，经皮或透皮。出于此目的的典型调配物包括凝胶、水凝胶、洗剂、溶液、乳膏、软膏、除尘粉剂、敷料、泡沫剂、薄膜、皮肤贴剂、糯米纸囊剂(wafer)、植入剂、海绵、纤维、绷带和微乳剂；也可使用脂质体。典型载剂包括醇、水、矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙三醇、聚乙二醇和丙二醇。可并入穿透增强剂；参看例如，finnin和morgan，《欧洲药物科学杂志(j.pharm sci)》88(10):955-958(1999)。局部给药的其它手段包括通过电穿孔法、离子导入疗法、超音波药物透入疗法、超声波导入疗法和微针或无针(例如， powderject
tm
、bioject
tm
等)注射来传递。用于局部给药的调配物可设计为立即释放和/ 或修饰释放。修饰释放调配物包括延迟、持续、脉冲、控制、靶向和程控的释放。
[0077]
有效免疫原性组合物也可通常以来自干粉吸入器的干粉(单独或作为混合物，例如以与乳糖的干掺合物，或作为混合组分粒子，例如与如磷脂酰胆碱的磷脂混合，)形式，或作为来自产生精细薄雾的加压的容器、泵喷雾、雾化器(优选地使用电流体动力学的雾化器)的喷雾剂喷雾鼻内或通过吸入来施用。所述有效免疫原性组合物也可通过喷雾器在使用或不使用合适的喷射剂的情况下施用，所述喷射剂如1,1,1,2-四氟乙烷或 1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷。对于鼻内使用，粉剂可包括生物粘附剂，例如壳聚糖或环糊精。加压的容器、泵、喷雾、雾化器或喷雾器含有本发明的一种或多种化合物的溶液或悬浮液、作为溶剂的一种或多种喷射剂和任选的界面活性剂，所述溶液或悬浮液包含例如乙醇、乙醇水溶液或用于使活性分散、溶解或延伸释放的合适的替代试剂，所述界面活性剂如脱水山梨糖醇三油酸酯、油酸或低聚乳酸(oligolactic acid)。
[0078]
在用于干粉或悬浮液调配物前，药品一般微粉化成适合于通过吸入传递的大小(通常小于约5微米)。这可由任何适当粉碎方法达成，如螺旋形喷射研磨、流体化床喷射研磨、超临界流体处理(以形成纳米颗粒)、高压均质化或喷雾干燥。
[0079]
供用于吸入剂或吹入器的胶囊(例如从明胶或羟基丙基甲基纤维素制得)、泡壳和筒柱可调配成含有本发明的化合物的粉剂混合物。合适的粉剂基质可以是乳糖或淀粉，且性能改质剂可以是l-白氨酸、甘露醇或硬脂酸镁。乳糖可以是无水的或呈单水合物形式。其它合适的赋形剂包括聚葡萄糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨醇、木糖醇、果糖、蔗糖和海藻糖。
[0080]
用于使用电流体动力学来产生精细薄雾的雾化器的合适的溶液调配物每喷一下可含有约1μg到约20mg的本发明的化合物，且喷出体积可在约1μl到约100μl的范围内变化。在另一实施例中，每喷一下化合物的量可在约100μg到约15mg、或约500μg 到约10mg、或约1mg到约10mg、或约2.5μg到约5mg的范围内变化。在另一实施例中，喷出体积可在约5μl到约75μl、或约10μl到约50μl、或约15μl到约25μl的范围内变化。典型调配物可包括本发明的化合物、丙二醇、无菌水、乙醇和氯化钠。可用于代替丙二醇的替代的溶剂包括甘油和聚乙二醇。
[0081]
用于吸入/鼻内给药的调配物可使用例如plga调配为立即释放和/或修饰释放的。修饰释放调配物包括延迟、持续、脉冲、控制、靶向和程控的释放。
[0082]
就干粉吸入剂和喷雾剂而言，剂量单位一般借助于传递定量的量的阀门来确定。根据本发明的单位通常被布置成施用定量的剂量或含有约10ng到约100μg本发明的化合物的“喷烟”。在另一实施例中，以定量的剂量施用的化合物的量为约50ng到约75μg、或约100ng到约50μg、或约500ng到约25μg、或约750ng到约10μg、或约1μg到约5μg。总的日剂量通常将在约1μg到约100mg的范围内，所述剂量可以单次剂量或更通常以全天分剂量施用。在另一实施例中，总日剂量可在约50μg到约75mg、或约 100μg到约50mg、或约500μg到约25mg、或约750μg到约10mg、或约1mg到约5 mg的范围内变化。
[0083]
本发明的有效免疫原性组合物也可以口服方式或经口地施用，也就是说，通过或借助于口腔施用到个体的身体中，且涉及通过口腔黏膜吞咽或传输(例如，舌下或颊内吸收或这两种)。合适的调味剂或甜味剂可加入打算用于口服或经口给药的本发明的那些调配物，所述调味剂如薄荷醇和左薄荷脑，所述甜味剂如糖精或糖精钠。
[0084]
本发明的有效免疫原性组合物可例如以栓剂、子宫托或灌肠剂形式经直肠或经阴道施用。可可油为传统的栓剂基质，但可按需要使用各种替代栓剂基质。用于经直肠/经阴道给药的调配物可调配为立即释放和/或修饰释放的。修饰释放调配物包括延迟、持续、脉冲、控制、靶向和程控的释放。
[0085]
本发明的有效免疫原性组合物也可通常以等张的ph调节的无菌盐水的微粉化悬浮液或溶液的液滴形式直接地施用到眼部或耳部。适合于经眼和经耳给药的其它调配物包括软膏、生物可降解(例如，可吸收凝胶海绵、胶原蛋白)和生物不可降解(例如，聚硅氧)植入剂、糯米纸囊剂、镜片和颗粒或囊系统，如非离子体或脂质体。聚合物、纤维素聚合物或杂多糖聚合物可与防腐剂一起并入，所述聚合物如交联的聚丙烯酸、聚乙烯醇、玻尿酸，所述纤维素聚合物例如羟基丙基甲基纤维素、羟基乙基纤维素或甲基纤维素，所述杂多糖聚合物例如琼脂糖(gelan)胶状物，所述防腐剂如苯扎氯铵。这类调配物也可通过离子导入疗法传递。用于经眼/经耳给药的调配物可调配为立即释放和/或修饰释放的。修饰释放调配物包括延迟、持续、脉冲、控制、靶向和程控的释放。
[0086]
本发明的免疫原性组合物不受常规生理学上可接受的载剂、佐剂或适用于上文所描述的类型的医药制剂的其它成分的选择的限制。所属领域的技术人员能够从上述组分制备具有适当ph值、等张性、稳定性和其它常规特征的这些医药学上可接受的组合物。
[0087]
一般而言，选择用于本发明的免疫原性组合物的组分的适当“有效量”或剂量还将基于所采用的免疫原性组合物中的抗原的特性以及个体的身体病症，所述身体病症最尤其包括免疫个体的一般健康状况、年龄和重量。给药的方法和途径和额外组分在免疫原性组
合物中的存在也可影响组合物的剂量和量。所属领域的技术人员能够进行这类选择且朝上或朝下调节有效剂量。诱发免疫反应或在个体中产生外源性效应而无明显不利副作用所需的组合物的量可视这些因素而定来变化，所述免疫反应优选地为保护性反应。合适的剂量易于由所属领域的技术人员确定。
[0088]
类似地，如果必需多于一次，那么免疫原性组合物给药的次序和单次给药之间的时段可由所属领域的技术人员基于身体特征和宿主对方法的应用的精确回应来选择。优选地，本发明的有效免疫原性组合物可向1天到3周龄的牛科动物施用。更优选地，所述有效免疫原性组合物可向1周到2周龄的牛科动物施用。应再注意，基于存在于任何特定饲养或放牧操作上的特定暴露风险，本发明的另一优选方面包括在任何年龄时使用本发明的修饰的活(减毒)的疫苗对牛犊进行接种疫苗，所述年龄如0周到3周的年龄、 0个月到2个月的年龄和0个月到6个月的年龄。对于包含经修饰的活牛支原体的有效免疫原性组合物，一般必需仅单次给药，且所述给药可在如上文所描述的年龄时的牛科动物中执行。然而，所述有效免疫原性组合物可施用多于一次，例如，在第一次接种疫苗之后2周到4周时间间隔时给予后续剂量。然而，视包括疾病在畜群中的发病率和特定致病性循环领域菌株的存在的各种因素而定，随时间推移向给定动物施用一个或多个剂量的本发明的活疫苗可以是适当的，无关于接种疫苗动物的年龄。由此，大龄动物也可接种疫苗，且可根据本发明的实践重复地接种疫苗，这对于雌性牛而言在发病之前和在怀孕期间为重要。由此，在一个其它优选实例中，即使雌性牛先前已接种疫苗，所述牛于怀孕开始之前2个月与4个月之间接种疫苗，且小牛在出生之后不久接种疫苗。在一些情况下，另外可适于在怀孕期间对母牛进行接种疫苗。
[0089]
对于其它类型的牛支原体疫苗(例如，杀死的或亚基)，初始给药组合物可在如上文概述的年龄时，其中后续给药在先前剂量之后2周到4周。
[0090]
试剂盒
[0091]
可需要单独地施用免疫原性组合物或施用免疫原性组合物与额外化合物的组合，例如，出于治疗特定疾病或病况的目的，在本发明的范围内免疫原性组合物可方便地以试剂盒的形式包含或以试剂盒的形式组合，所述试剂盒适合于施用或共施用组合物。本发明的试剂盒可包含一种或多种独立医药组合物和用于单独地保存所述组合物的构件，所述医药组合物中的至少一种是根据本发明的免疫原性组合物，所述构件如容器、分隔瓶或分隔箔包。这种试剂盒的一个实例是注射器和针和类似物。本发明的试剂盒尤其适用于施用不同剂型(例如口服或非经肠)，适用于以不同给药时间间隔施用独立组合物，或适用于针对彼此滴定独立组合物。为辅助施用本发明的组合物，试剂盒通常包含给药说明书。
[0092]
本发明的另一试剂盒可包含适用于检测牛支原体的一种或多种试剂。试剂盒可包括用于分析完整牛支原体、或牛支原体多肽、表位或多核苷酸序列的存在的样本的试剂。在某些实施例中，试剂盒可包括一组打印的说明，或指示试剂盒适用于检测受牛支原体感染的动物的标签。
[0093]
抗体(antibody/antibodies)
[0094]
抗体可以是单克隆、多克隆或重组的。抗体可针对免疫原或其一部分制备。举例来说，基于免疫原的氨基酸序列或通过克隆技术重组制备的合成肽或天然基因产物和/或其部分可被分离并用作免疫原。免疫原可用于通过所属领域的技术人员熟知的标准抗体产生技术来产生抗体，所述标准抗体产生技术如一般描述于以下中：harlow和lane《抗体：实验
室手册(antibodies:a laboratory manual)》，冷泉港实验室，纽约州冷泉港， (1988)；和borrebaeck，《抗体工程技术—实践指南(antibody engineering-a practicalguide)》，w.h.freeman和co.(1992)。通过所属领域的技术人员已知的方法，抗体片段也可由抗体制备并且包括fab、f(ab')2和fv。
[0095]
在本发明的一个实施例中，本发明的抗体进一步提供能够通过定位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点来特异性结合到靶标的完整免疫球蛋白，所述靶标如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等。完整抗体具有两条轻链和两条重链。由此，单一分离的完整抗体可以是多克隆抗体、单克隆抗体、合成抗体、重组抗体、嵌合抗体或异源嵌合抗体。
[0096]
在抗体产生中，对所要抗体的筛选可通过所属领域中已知的免疫学标准方法来实现。未特别描述的技术一般遵循如下：stites等人(编)，《基础临床免疫学(basic andclinical immunology)》(第8版)，appleton和lange，康涅狄格州诺瓦克(1994)；和 mishell和shiigi(编)，《细胞免疫学中所选择的方法(selected methods in cellularimmunology)》，w.h.freeman和co.，纽约(1980)。一般而言，elisa和西方墨点法是免疫分析的优选类型；两种检定均是所属领域的技术人员熟知的。多克隆和单克隆抗体两种均可用于检定。如在所属领域中熟知的，抗体可结合到固体载体底物，或与可检测部分轭合，或同时结合和轭合。(对于轭合荧光或酶部分的一般论述，参看johnstone 和thorpe，《实用免疫化学(immunochemistry in practice)》，布莱克威尔科学公开 (blackwell scientific publications)，牛津(1982)。)抗体与固体载体底物的结合也是所属领域中熟知的。(对于一般论述，参看harlow和lane(1988)以及borrebaeck(1992)。) 涵盖以用于本发明的可检测部分可包括但不限于荧光、金属、酶和放射性标记物，例如生物素、金、铁蛋白、碱性磷酸酶、b-半乳糖苷酶、过氧化酶、尿素酶、荧光素、罗丹明、氚、
14
c以及碘化物。
[0097]
重组技术
[0098]
在本发明的又其它实施例中，免疫原性组合物可包含重组疫苗。这类重组疫苗将一般包含载体和包含牛支原体抗原的异源插入物。合适的牛支原体抗原可包括膜和膜缔合蛋白质，包括但不限于可变表面蛋白(vsp)；粘附素(cytadhesin)；脂蛋白，例如p48 和p68；以及仍待研究和表征的潜在其它假设的蛋白质。
[0099]
插入物可任选地包含异源启动子，如所属领域中已知的合成启动子。可替代地，宿主载体的启动子可对插入物的表达施加转录控制。启动子(视载体的选择而定，其可以是天然或异源的)的合适的非限制性实例是h6牛痘启动子、i3l牛痘启动子、42k痘病毒启动子、7.5k牛痘启动子和pi牛痘启动子。
[0100]
合适的载体已描述于本技术中的其它处。在一些实施例中，载体可以是病毒载体，包括但不限于牛痘和痘病毒载体，如羊痘、浣熊痘、猪痘和不同禽痘载体(例如，金丝雀痘和鸡痘菌株)。当前涵盖的菌株包括d1701、alvac、trovac、nyvac菌株。一般来说，病毒宿主非必需的序列是用于本发明的插入物的合适的插入位点。上述菌株在所属领域中充分表征，且这些载体中的一些插入位点是熟知的。参看例如，美国专利第 5,174,993号；美国专利第5,505,941号；美国专利第5,766,599号；美国专利第5,756,103 号；美国专利第7,638,134号；美国专利第6,365,393号。
[0101]
存在数个可用于克隆和表达本发明的核苷酸序列的已知方法或技术。举例来说，
序列可分离为限制片段，且克隆到克隆和/或表达载体中。序列也可pcr扩增及克隆到克隆和/或表达载体中，或所述序列可通过组合这两种方法来克隆。所属领域中已知且未特别描述的标准分子生物学技术可一般遵循如下中所描述：sambrook等人，《分子克隆实验指南(molecular cloning:a laboratory manual)》，冷泉港实验室出版社，纽约(1989)； ausubel等人，《现代分子生物学实验技术(current protocols in molecular biology)》，johnwiley and sons(john wiley&sons)，马里兰州巴尔的摩(1989)；perbal，《分子克隆实践指南(a practical guide to molecular cloning)》，约翰
·
威利父子出版公司，纽约(1988)； watson等人，《重组dna(recombinant dna)》，《美国科学书籍(scientific americanbooks)》，纽约；birren等人(编)《基因组分析：实验室手册系列(genome analysis:alaboratory manual series》，第1到4卷，冷泉港实验室出版社，纽约(1998)；以及阐述于美国专利第4,666,828号、第4,683,202号、第4,801,531号、第5,192,659号和第 5,272,057号中的方法。聚合酶链反应(pcr)一般如《pcr方法：方法和应用指南(pcrprotocols:a guide to methods and applications)》，学术出版社(academic press)，加利福尼亚州圣地亚哥(1990)中所描述来执行。
[0102]
本发明涵盖使用原核和真核表达系统，包括载体和宿主细胞，其可用于表达通过本发明的核苷酸序列表达的截短和全长形式的重组多肽两种。各种宿主表达载体系统可用于表达本发明的多肽。这类宿主表达系统还表示可克隆和随后纯化所关注的编码序列的媒剂。本发明进一步提供宿主细胞，其可在经适当载体或核苷酸序列转换或转染时表达本发明的已编码的多肽基因产物。这类宿主细胞包括但不限于微生物，如经含有编码序列的重组噬菌体dna、质体dna或粘质体dna表达载体转换的细菌(例如，大肠杆菌(e.coli)、枯草杆菌(b.subtilis))；经含有基因产物编码序列的重组酵母菌表达载体转换的酵母菌(例如，酵母(saccharomyce)、毕赤酵母(pichia))；经含有编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；经重组病毒表达载体(例如，花椰菜嵌纹病毒，camv；烟草花叶病毒，tmv)感染或经含有编码序列的重组质体表达载体(例如，ti质体)转换的植物细胞系统；或具有重组表达构筑体的哺乳动物细胞系统(例如，cos、cho、bhk、293、3t3)，所述构筑体含有来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5k启动子)。
[0103]
一般来说，本发明的载体可来源于但不限于细菌质体、噬菌体、酵母菌游离基因、酵母菌染色体元件、病毒(例如，如上文所描述的病毒)、哺乳动物染色体以及其组合，如来源于质体和噬菌体基因元件的那些载体，所述噬菌体基因元件包括但不限于粘粒和噬菌粒。
[0104]
本发明的载体可用于表达牛支原体多肽。一般来说，本发明的载体包括可操作地连接到编码待表达的多肽的聚核苷酸的顺式作用调节区。调节区可以是组成型或诱导型的。由宿主在引入到宿主中时通过体外转译系统、通过补充载体或通过载体自身供应适当反式作用因子。
[0105]
本发明的载体可包括通常包括于表达或展示载体中的任何元件，包括但不限于复制起点序列、一种或多种启动子、抗生素抗性基因、前导或信号肽序列、各种标签序列、可对基因进行编码的填充序列、限制位点、核糖体结合位点、转译强化子(能够形成用于转录后mrna稳定性的茎环结构的序列)、对不具有终止密码子的氨基酸进行编码的序列和对细菌
鞘蛋白进行编码的序列，所述基因的多肽赋予抗生素抗性。
[0106]
本发明通过以下实例进一步说明，但决不限于以下实例。
[0107]
实例1.产生和分离牛支原体突变体。
[0108]
从牛的关节分离的牛支原体(昆士兰州米尔梅伦；1999)在牛(“牛(bovis)”)支原体培养液(pplo；酵母萃取；酚红；热灭活的，γ照射的猪血清)中传代两次、在牛琼脂上过滤克隆4x，且随后进一步在培养液中传代。制备菌株的培养物(10ml)，且在适当温度下培养24小时。在那段时间之后，培养物通过在4℃下以13,000g离心10分钟来收集。所得沉淀物(pellet)用1ml磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤3次。最终沉淀物在1ml pbs中再悬浮，且在两个1.5ml微量离心管(eppendorf tube)之间分流。菌株 (指定3683)使用化学甲硝基亚硝胍(ntg)来突变诱发。根据nonomura和imada(《禽流感疾病(avian dis.)》26(4):763-775；1982)中最初描述的方法来产生和选择牛支原体温度敏感突变体。在突变诱发和表型选择之后，在牛培养液中执行过滤克隆和传代。
[0109]
小牛用指定3683#22/3/12的温度敏感突变体的纯化克隆株鼻内接种。牛支原体分离株n2805-1随后根据以下程序从拭子获得，所述拭子从特定小牛的鼻咽收集：将含有在感染之后28天收集的鼻部拭子材料的支原体培养液涂覆在pplo琼脂板上，所述琼脂板随后在38.3℃下于5％co2氛围中培养。挑选单个菌落且转移到pplo培养液，并在38.3℃下于5％co2氛围中培养48小时。为了获得单个菌落，培养液培养物随后穿过无菌0.45微米滤纸，在盐水中稀释，且涂覆在pplo琼脂上。总共进行8次传代，在培养液和板之间交替，其中培养液阶段于涂覆之前过滤以获得单个菌落。这总共产生3个过滤/克隆步骤。最终培养液代分成2个等分试样，所述等分试样随后在-80℃下存储。冻结的等分试样随后解冻，且用于接种60ml pplo培养液。在38.3℃下于5％co2中培育48小时之后，培养物分配成1.25ml等分试样，且在-80℃下冻结，以充当工作储备液。解冻一瓶储备液，且用于接种200ml pplo培养液，所述液体随后在37℃下于5％co2中培养24小时。培养物随后分配成1.25ml等分试样且在-80℃下冻结。所有后续工作使用这种材料(“第10代”)进行。
[0110]
因为用于对最终还原n2805-1的小牛进行接种疫苗的菌株是温度敏感的，所以评估限制性温度(38.3℃)和容许性温度(33℃)两种温度下n2805-1的表型特征。如果n2805-1 在限制性温度下的增长不比在容许性温度下的增长更好，那么至少与在容许性温度下的增长一样好(表1)，从而指示n2805-1不再展现温度敏感表型。
[0111]
表1.
[0112]
经过的时间(小时)33℃38.3℃07.67e+055.67e+0515.52.33e+068.67e+0618.52.00e+071.77e+0721.54.80e+073.67e+07244.33e+075.43e+0739.51.83e+081.20e+08
[0113]
在独立研究中，n2805-1的增长率与温度敏感突变体3683#22/3/12的增长率以及衍生所述n2805-1的亲本菌株(3683)相比较。含有10％猪血清的pplo培养液用1％(v /v)的每种菌株的解冻的冻结储备培养物接种。制备重复培养液培养物，且一种在33℃下培养，且
另一种在38℃下培养，这两种都在5％co2的情况下培养。在培育后42小时，从每种培养物移除0.1ml等分试样，且通过连续稀释确定cfu/ml，且在pplo琼脂上确定板计数。板在与对应培养液培养物相同的温度下在5％co2的情况下培养5到 7天。图1中的结果证明在培育后42小时，n2805-1不再与3683#22/3/12一样温度敏感。
[0114]
为了基因型地表征n2805-1，测序全基因组，且与它来源于的亲本野生型(wt，预诱变处理的)菌株3683的基因组相比较。那个尝试的结果是在3683牛支原体菌株与衍生n2805-1菌株之间鉴别出12个不同单核苷酸差异(单核苷酸多态性，或snp)。迄今为止，那些12个snp中的5个已由pcr确认。那5个snp的核苷酸和氨基酸序列中的示范性变化展示于表2中(从菌株3683到分离株n2805-1)。
[0115]
表2.
[0116][0117][0118]
实例2.经修饰的活牛支原体疫苗菌株对抗毒性牛支原体异源攻击的疗效。
[0119]
临床上健康、禁食初乳(cd)的小牛参与研究。通过elisa所有小牛是对牛支原体抗体血清反应阴性的(≤1:1600滴定度)，且在第0天之前收集的的鼻部拭子中的牛支原体是pcr阴性的。
[0120]
所有小牛在耳部切口测试中为bvdv持久感染阴性的。动物由治疗组在本研究的接种疫苗阶段期间以单个围栏容纳于独立房间中。治疗组在四个攻击房间中共混杂，且在攻击阶段期间由块状物容纳。记录在研究过程期间出现在牛犊中的任何不良事件。
[0121]
在研究的第0天(sd 0)，1到2周大的动物鼻内施用以下疫苗中的一种(表3)： t01，盐水；t02，牛支原体疫苗菌株n2805-1；t03，参考实验的牛支原体疫苗(减毒活的)；t04，温度敏感的更早代的牛支原体疫苗菌株n2805-1。在sd 29到sd 31，所有动物由具有牛支原体堪萨斯(kansas)菌株110la-11-10的喷雾攻击。小牛使用连接到喷雾器的较小面罩(犬麻醉罩)通过含有气溶胶化牛支原体攻击的室来攻击。四个喷雾器连接到每个室，所述室随后由单个管连接到四只小牛。动物随后在sd 56尸检；所收集的样本/组织包括：肺组织，用于pcr；肺拭子，1个用于分离牛支原体，且1个用于其它细菌；扁桃体组织；气管支气管的淋巴结；以及肺病变组织。
[0122]
表3.
[0123][0124]
结果.逆转换最小平方均值(btlsm)肺病变得分(lls)结果在表4中列出。施用到治疗组t02、t03和t04的疫苗与t01盐水对照组相比诱发明显减少肺部病变(分别 0％、1％和1％比17％)。
[0125]
表4.
[0126][0127]
1.具有相同字母的治疗组在α＝.10时没有明显差异。
[0128]
发热(》103.1℉)的平均持续时间在表5中指示。所有三个接种疫苗治疗组在与对照组相比时具有明显更少的发热天数。
[0129]
表5.
[0130]
治疗编号估计1下90％ci上90％cit013.6b1.76.8t020.9a0.12.2t031.4a0.43.2t041.1a0.22.5
[0131]
1.一列内的不同上标表示组之间的明显差异。
[0132]
在攻击之后，t01组具有与牛支原体呼吸道疾病相关的临床疾病的平均4.7天的持续时间。这分别与t02、t03和t04组的0.7天、1.2天和2.5天对照(表6)。t02和t03 小牛与t01小牛相比具有明显减少的至少一种临床征象的平均持续时间(p《0.0009和 p《0.0265)。
[0133]
t02、t03和t04组受保护免于牛支原体诱发的疾病，如与t01组相比，更少动物展现咳嗽、跛行和呼吸努力(respiratory effort)的临床症状和更短的持续时间。无任何组的动物展现流鼻涕。接受疫苗接种的耳朵下垂/头部倾斜确实比t01组略微频繁(表7)。
[0134]
表6.
[0135]
治疗编号估计1下95％ci上95％cit014.7a2.39.1t020.7b0.11.5t031.2b0.22.9t042.5a0.95.2
[0136]
1.一列内的不同上标表示组之间的明显差异。
[0137]
表7.
[0138][0139][0140]
在整个研究期间每周收集鼻部拭子且由pcr测试牛支原体。接种疫苗组由pcr的检测从第7天到第21天达到峰值。t01对照组在接种疫苗阶段期间保持pcr阴性。100％的t02和t04小牛以及93.3％的t03小牛在研究期间是pcr阳性的(表8)。
[0141]
表8.
[0142][0143]
所有动物于开始研究之前是牛支原体血清阴性的(elisa滴度为≤1:1600，或几何平均值≤800)。在第7天检测t02和t04小牛的血清转化，且在第14天检测t03组的血清转化。滴定度平均值在所有组中较低直到攻击之后(表9)。
[0144]
经粘膜iga抗体对接种疫苗和攻击的反应在鼻部分泌物中使用牛支原体特异性igaelisa来监测。》1:50的截止值用于定义阳性反应。iga抗体滴定度由接种疫苗诱发，且一般随研究发展而增加。t02、t03和t04小牛的iga滴定度从第7天到第55天比 t01动物的所述滴定度高。t01和t02组的峰值反应为第43天，且t03和t04组的为第55天(表10)。
[0145][0146]
肺、扁桃体和气管支气管的淋巴结样本的牛支原体*由pcr测试。(*无乳支原体也可在这pcr检定中扩增。)牛支原体回复与对照组相比在肺和淋巴结组织样本的所有三个接
种疫苗治疗组中更不频繁。所有治疗组的来自扁桃体的回复较高(表11)。
[0147]
表11.
[0148][0149]
*pcr数据来自尸检时所收集的组织。
[0150]
从t02、t03和t04小牛的肺拭子分离牛支原体(尸检日)的速率31.3％、40.0％和 33.3％与t01对照组的87.5％相比较低。所测试的所有其它细菌病原体的肺拭子是阴性的(表12)。
[0151]
表12.
[0152][0153]
*无乳支原体也可在这pcr检定中扩增。
[0154]
ifnγelispot检定在接种疫苗和攻击之后测量细胞介导的免疫的诱发。在表13 中列出ifnγ斑点形成细胞(sfc)/百万btlsm(第-1天和第42天)和几何平均值(第 7天和第14天)。
[0155]
表13.
[0156][0157][0158]
总之，n2805-1疫苗候选疫苗(t02)提供明显减少的肺病变得分。攻击后疾病的直肠温度和临床症状的严重程度和持续时间由n2805-1减少。血清抗体滴定度、iga滴定度和pcr以及培养物结果也支持这种菌株的疗效。因此，n2805-1疫苗是评估安全性和进一步疗效研究的良好候选疫苗。
[0159]
实例3.温度敏感突变体3863 22/3/12和非温度敏感突变体n2805-1的基因组表征。
[0160]
企图表征牛支原体温度敏感突变体3683#22/3/12与非温度敏感突变体n2805-1之
间的基因组差异，使用illumina技术测序两个的基因组，所述非温度敏感突变体从已接种3683#22/3/12的小牛分离。准备dna库，测序带条码的样本以获得60x覆盖度的每个样本的双末端序列的平均值。对所有读数执行质检，失败的和低质量的读数在映射和单核苷酸多态性(snp)分析之前移除。序列读数使用clc基因组学工作台软件 (qiagen；加利福尼亚州雷德伍德城)映射到参考基因组(hubei-1；基因库寄存编号 cp002513)。来自clc基因组学工作台的变体检测模块用于snp发现。snp的特性和位置展示于表14中。在两种突变体菌株之间，鉴别56种snp，其中的17使得氨基酸变化(包括使得引入终止密码子的2种)，其中的6种使得移框突变，且其中的33种出现在非编码区。
[0161]
表14.
[0162]
[0163][0164]
*对snp位置的编号是基于牛支原体参考菌株hubei-1(基因库寄存编号cp002513)。
[0165]
#
从菌株3863#22/3/12到菌株n2805-1出现的核苷酸和氨基酸变化。
[0166]
已减毒以及表征来自牛的牛支原体菌株。所述牛支原体菌株的分离株在2015年5 月12日寄存于美国典型培养物保藏中心(“atcc”，美国弗吉尼亚州马纳萨斯)，且已指定寄
存编号pta-122167，其分类命名为牛支原体(mycoplasma bovis)n2805-1 k-uc1004。
[0167]
综上所述，本发明提供以下实施方案：
[0168]
1.一种有效免疫原性组合物，包含化学减毒的牛支原体菌株，其中所述菌株以寄存编号pta-122167寄存于美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)。
[0169]
2.根据实施方案1所述的免疫原性组合物，其中所述化学减毒的牛支原体菌株相比于亲本菌株包含硝基还原酶、组氨酸磷酸酶、切除核酸酶abc亚基b、dna聚合酶iii 亚基β和atp合成酶f1亚基δ中的一种或多种中的一个或多个突变。
[0170]
3.一种有效免疫原性组合物，包含化学减毒的牛支原体菌株，其中所述菌株是 pta-122167，另外其中所述菌株已逆向工程改造成在根据牛支原体菌株hubei-1的参考基因组的核苷酸编号的以下位置处含有牛支原体菌株3683#22/3/12中的原始核苷酸中的任一种中的一个或多个：115273、194478、194484、194525、194724、204966、207629、 262327、271487、271661、271666、272086、272133、309463、310075、310078、310086、 310090、311988、334184、358013、365101、365188、397010、397901、399129、410247、 410253、410334、410514、410733、414666、453388、468457、502577、502678、502963、 543859、560986、632309、632366、632612、633994、686074、687874、687915、696348、 729874、730046、761587、761663、761810、761815、765176、765328和765403。
[0171]
4.根据实施方案1到3中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述牛支原体菌株经灭活。
[0172]
5.根据实施方案4所述的免疫原性组合物，其中所述组合物可另外包含佐剂。
[0173]
6.根据实施方案4所述的免疫原性组合物，进一步包含至少一种额外抗原。
[0174]
7.根据实施方案6所述的免疫原性组合物，其中所述额外抗原选自由以下组成的组：病毒、细菌、真菌和寄生虫。
[0175]
8.根据实施方案1到7中任一项所述的免疫原性组合物，其中所述组合物调配成通过选自由以下组成的组的途径来施用：肌肉内、皮下、鼻内、气管内、口服和喷雾。
[0176]
9.一种用于预防由牛科动物的牛支原体引起的疾病的方法，包含向所述动物施用免疫量的根据实施方案1到5中任一项所述的免疫原性组合物。
[0177]
10.一种用于预防由牛科动物的牛支原体和另一感染因子引起的疾病的方法，包含向所述动物施用免疫量的根据实施方案6到7中任一项所述的免疫原性组合物。
[0178]
11.一种根据实施方案1到5中任一项所述的免疫原性组合物的用途，用于制造用于预防由牛科动物的牛支原体引起的疾病的药剂。
[0179]
12.一种牛支原体疫苗，由包含以下的步骤产生：
[0180]
a.获得以pta-122167寄存于atcc的牛支原体培养物；
[0181]
b.使所述牛支原体培养物进一步传代至少一次；
[0182]
c.从传代培养物分离克隆株；以及
[0183]
d.用载剂或赋形剂和任选佐剂调配所述克隆株。
[0184]
13.根据实施方案12所述的疫苗，其中从所述传代培养物获得的所述克隆株相较于 pta-122167进一步减毒。
[0185]
14.一种提供牛支原体疫苗的方法，其中所述疫苗由包含以下的步骤产生：
[0186]
a.获得以pta-122167寄存于atcc的牛支原体培养物；
[0187]
b.使所述牛支原体培养物进一步传代至少一次；
[0188]
c.从传代培养物分离克隆株；以及
[0189]
d.用载剂或赋形剂和任选佐剂调配所述克隆株。
[0190]
15.一种诱变处理牛支原体亲本菌株的方法，其中所述方法包含使所述菌株经受化学诱变，随后选择在活体外连续传代之后仍然有活性的后代菌株，另外其中所述方法产生以寄存编号pta-122167寄存于美国典型培养物保藏中心的菌株。
[0191]
16.根据实施方案15所述的方法，其中所述亲本菌株是牛支原体菌株3683。
[0192]
17.根据实施方案15所述的方法，其中所述后代菌株以寄存编号pta-122167寄存于美国典型培养物保藏中心。
[0193]
18.根据实施方案15所述的方法，其中所述后代菌株在根据牛支原体菌株hubei-1 的参考基因组的核苷酸编号的以下位置处含有原始核苷酸中的任一种中的一个或多个： 115273、194478、194484、194525、194724、204966、207629、262327、271487、271661、 271666、272086、272133、309463、310075、310078、310086、310090、311988、334184、 358013、365101、365188、397010、397901、399129、410247、410253、410334、410514、 410733、414666、453388、468457、502577、502678、502963、543859、560986、632309、 632366、632612、633994、686074、687874、687915、696348、729874、730046、761587、 761663、761810、761815、765176、765328和765403。