一种表达ASFVD117L基因的重组PRRSV的拯救方法和应用与流程

本发明属于基因工程及疫苗制备，具体涉及一种表达asfv d117l基因的重组prrsv的拯救方法和应用。

背景技术：

1、非洲猪瘟(african swine fever,asf)是由非洲猪瘟病毒(africanswinefevervirus,asfv)引起的猪的一种高热、严重出血、神经症状为主要特征的高度接触传染性疾病，致死率高达100％，对养猪业的影响巨大。世界动物卫生组织(oie)将其列为a类动物疫病，我国将此病归为重点防范的一类动物传染病。1921年，非洲猪瘟在非洲肯尼亚首次被发现，全世界至今没有研制出有效的疫苗。

2、asfv为一种有囊膜的二十面体对称的大型双链dna虫媒病毒，能够感染家猪、野猪，是非洲猪瘟病毒科的唯一成员，平均粒子直径在200nm左右，结构复杂，其基因组全长约179～193kb，含有150～167个开放阅读框(open reading frames，orfs)，编码超过200种蛋白质，其中约50多种是病毒的结构蛋白。同时asfv基因组还编码dna复制、基因转录和rna修饰相关酶类，以及调节宿主细胞功能和参与病毒免疫逃逸的相关蛋白质。

3、p17蛋白是asfv表达的晚期内囊膜蛋白，定位于衣壳和内部脂质包膜，由基因d117l编码，其大小约为13.1kd。该蛋白是促进病毒囊膜前体物质转变为正二十面体结构的必需蛋白，并且对增强病毒活力至关重要。当p17蛋白表达受阻时，将抑制pp220和pp62蛋白的水解，进而抑制病毒核衣壳的组装过程，影响病毒颗粒的产生。研究表明，p17蛋白是重要的抗原蛋白，能够用于asfv的疫苗研究。

4、猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，prrs)是猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratorysyndromevirus,prrsv)引起的一种猪传染病，其特征是引起生长和育肥猪的呼吸系统疾病以及妊娠母猪的繁殖障碍，是目前对世界养猪业造成危害最大的重要传染病之一。prrsv具有严格的宿主特异性及组织嗜性，主要感染猪的肺泡巨噬细胞和树突状细胞，引起急性或持续性感染。

5、prrsv的遗传和抗原多样性，以及prrsv感染的免疫抑制和持久性，对开发有效疫苗提出了巨大挑战。然而，反向遗传学的发展为体外拯救rna病毒铺平了道路。这项技术使在分子水平上操纵病毒基因组成为可能。为开发prrsv作为表达外源基因的病毒载体和构建转基因疫苗提供了有效途径。通过利用prrsv复制过程中多个亚基因组rna(sgrna)的独特转录和翻译，构建表达多个外源基因的重组prrsv变的可行。

6、研究显示，当使用prrsv感染性克隆作为表达载体时，已经报道了几个插入位点，包括nsp2、orf1b和orf2a之间的区域，以及orf7和3'-utr之间的位点。其中，prrsv orf1b和orf2a之间的区域是外来序列的理想插入位点，因为该区域不与其他基因重叠，因此可以通过插入一个额外的独立转录单位来产生额外的亚基因组(sg)mrna。有研究表明，在prrsv的orf1b和orf2之间的插入gfp即使在连续传代37次后仍是稳定的，而在该位置插入pcv2衣壳蛋白的重组病毒接种动物之后可检测到针对插入基因的特异性抗体。这些结果表明，插入的外源基因被重组prrsvs有效表达，并具有良好的免疫原性，可在宿主体内激发强烈的免疫反应。因此，这些重组病毒有可能被开发为针对猪病的多价多联疫苗。

7、目前有很多关于asf疫苗的报道，但是灭活苗、弱毒苗、亚单位疫苗等都不能有效地保护猪，至于病毒活载体疫苗的研究，有选用腺病毒作为载体来表达asfv保护性抗原基因，可以检测到特异性抗体。因此，病毒活载体疫苗是未来非洲猪瘟疫苗研发的重要方向。综上所述，由于目前还没有针对asfv感染的有效疫苗，本发明通过以prrs为载体，在其基因组orf1b和orf2之间插入非洲猪瘟抗原基因d117l，构建稳定表达asfvp17蛋白的prrsv重组病毒，为进一步研制开发非洲猪瘟及其他猪病疫苗或疫苗组合奠定重要基础。

8、但是，根据现有资料表明(韩焘,张硕,吴佳俊等.高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗株jxa1-r感染性克隆的构建与鉴定[j].中国兽医学报.2016,36(11):1818-1822；gao f,jiang y,li g,et al.porcine reproductive and respiratory syndrome virusexpressing e2 of classical swine fever virus protects pigs from a lethalchallenge of highly-pathogenic prrsv and csfv[j].vaccine.2018,36(23):3269-3277)，当前利用prrsv作为载体构建重组病毒疫苗时，存在如下问题：

9、1.以prrsv作为载体构建重组病毒感染性克隆时，能否获得忠实性的prrsv全基因组cdna及准确插入外源基因片段是其中最为关键的一环。目前在构建表达外源基因的prrsv全长cdna克隆时，首先需要对全基因组序列及要插入的片段进行酶切位点分析，该方法酶切位点选取限制较多，只有当载体和序列存在常用单一酶切位点时，酶切连接方法才可行，一旦载体和序列中同时存在多个该酶切位点或没有合适酶切位点时，这时酶切连接的方法就用不了。即使对插入的某一片段有合适的酶切位点，但是当插入另外的片段时，由于序列的不同，酶切位点发生变化，每次插入不同的片段需要设计不同的酶切位点甚至需要对基因组序列进行突变才能有合适的酶切位点可用，导致序列的保真性受到影响，不利于病毒拯救。同时，酶切连接方法也存在大片段连接效率较低、获得表达外源基因的病毒基因组全长cdna非常困难等问题，pcr产物、插入片段与载体都要通过反复的酶切，电泳，回收等步骤，才能进行下一步的连接。这样既耗费时间，而且连接的效率不是很理想。

10、2.由于prrsv基因组较大，在构建全长重组cdna克隆质粒时，需要对其基因组进行分段扩增，然后将每一段都亚克隆到载体上，再将这些片段一步一步进行酶切连接，最后克隆到同一个载体上，步骤繁琐，并且亚克隆构建过程中存在基因序列突变、缺失等风险，导致最后拼接的全长cdna质粒基因序列不准确，救毒效率低下。

11、3.prrsv重组毒反向遗传救毒时，采用原核启动子载体，即将病毒的全基因组置于原核启动子(如噬菌体t7、t3、sp6启动子)之后的方法，在拯救病毒的过程中，首先需要将获得的全长质粒线性化，再进行体外转录获得病毒的全基因组rna，最后再通过rna转染细胞才能完成病毒的拯救。该方法需要在体外获得病毒rna并进行rna转染，但是由于体外转录获得的rna具有异质性和体外rna的不稳定性等问题，采用此种方法进行病毒的拯救有可能拯救不出重组病毒或者得出不准确的试验结论。

12、因此，提供一种快速高效拯救表达外源基因重组prrsv的方法具有显著的创新意义。

技术实现思路

1、针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种表达asfv d117l基因的重组prrsv的拯救方法。

2、本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法得到的表达asfv d117l基因的重组prrsv。

3、本发明的再一目的在于提供上述表达asfv d117l基因的重组prrsv在制备非洲猪瘟疫苗中的应用。

4、本发明目的通过以下技术方案实现：

5、一种表达asfv d117l基因的重组prrsv的拯救方法，包括如下步骤：

6、(1)以pbr322-cmv质粒或pbr322-cmv-rjxa1r质粒作为模板，以pbr322-cmv-f/pbr322-cmv-r作为引物进行扩增得到目的片段pbr322-cmv-linear；

7、(2)以pbr322-cmv-rjxa1r质粒作为模板，以prrsv-f4a/prrsv-orf1-r作为引物进行扩增得到目的片段segment4a；

8、(3)以pmd19-p17质粒作为模板，以p17-0f/p17-416r作为引物进行扩增得到目的片段p17；

9、(4)以pbr322-cmv-rjxa1r质粒作为模板，以prrsv-orf2-0f/prrsv-r4b作为引物进行扩增得到目的片段segment4b；

10、(5)以pbr322-cmv-linear作为载体，segment4a、p17、segment4b作为插入片段进行同源重组，得到pbr322-cmv-segment4-p17质粒；

11、(6)以pbr322-cmv-rjxa1r质粒作为模板，分别以prrsv-f1/prrsv-r1、prrsv-f2/prrsv-r2、prrsv-f3/prrsv-r3和prrsv-f5/prrsv-r5作为引物进行扩增得到目的片段prrsv-segment 1、prrsv-segment 2、prrsv-segment 3和prrsv-segment 5；

12、(7)以pbr322-cmv-segment4-p17质粒作为模板，以prrsv-f4/prrsv-r4作为引物进行扩增得到目的片段prrsv-segment4-p17；

13、(8)以pbr322-cmv-linear作为载体，prrsv-segment 1、prrsv-segment 2、prrsv-segment 3、prrsv-segment 5和prrsv-segment4-p17作为插入片段进行同源重组，得到pbr322-cmv-rjxa1r-p17质粒；

14、(9)将pbr322-cmv-rjxa1r-p17质粒转染细胞表达，得到重组prrsv；

15、所述各引物序列如下：

16、pbr322-cmv-f：gggtcggcatggcatctc(seq id no：1)；

17、pbr322-cmv-r：ggtagcgctagcggatctgac(seq id no：2)；

18、prrsv-f4a：gtcagatccgctagcgctaccctccgtacgccactgcc(seq id no：3)；

19、prrsv-orf1-r：ggtggcttcaattcaggcctaaag(seq id no：4)；

20、p17-0f：ctttaggcctgaattgaagccaccatggacactgaaacgtctccac(seq id no：5)；

21、p17-416r：gttccgctgaaactctggttaaaggggttgccgcggaattatgaatgcgcaagttcagc(seq id no：6)；

22、prrsv-orf2-0f：aaccagagtttcagcggaactatgaaatgg ggtctatgc(seq id no：7)；

23、prrsv-r4b：gagatgccatgccgacccctcactacatcggtcatgc(seq id no：8)；

24、prrsv-f1：tcagatccgctagcgctaccatgacgtataggtgttggctctatgc(seq id no：9)；

25、prrsv-r1：gcatcacaagcctcacgcatg(seq id no：10)；

26、prrsv-f2：catgcgtgaggcttgtgatgc(seq id no：11)；

27、prrsv-r2：cgcaggattgcgacacc(seq id no：12)；

28、prrsv-f3：ggtgtcgcaatcctgcgg(seq id no：13)；

29、prrsv-r3：ggcagtggcgtacggag(seq id no：14)；

30、prrsv-f4：ctccgtacgccactgcc(seq id no：15)；

31、prrsv-r4：ctcactacatcggtcatgc(seq id no：16)；

32、prrsv-f5：gcatgaccgatgtagtgagaacg(seq id no：17)；

33、prrsv-r5：gatgccatgccgacccttttttttttttttttttttttttttttttttttaattacggccgcatggttctcgc(seq id no：18)。

34、进一步地，步骤(1)～(4)中所述扩增条件为：98℃变性2min，1个循环；98℃变性20s，55-60℃退火20s，72℃延伸按2-4kbp/min，34个循环；最后72℃延伸5min。

35、进一步地，步骤(5)中所述同源重组条件为：

36、

37、进一步地，步骤(6)～(7)中所述扩增条件为：98℃变性2min，1个循环；98℃变性20s，55-60℃退火20s，72℃延伸按2-4kbp/min，34个循环；最后72℃延伸5min。

38、进一步地，步骤(8)中所述同源重组条件为：

39、

40、进一步地，步骤(9)中所述转染细胞表达的步骤为：将marc145细胞传代培养，然后将质粒pbr322-cmv-rjxa1r-p17转染细胞，转染后收获细胞及培养上清，于-80℃反复冻融，离心后收取上清得到病毒液。

41、一种表达asfv d117l基因的重组prrsv，通过上述方法制备得到。

42、上述表达asfv d117l基因的重组prrsv在制备非洲猪瘟疫苗中的应用。

43、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

44、(1)在构建表达外源基因的重组prrsv全长cdna克隆时，采用同源重组的方式，通过引物设计添加具有相互重叠区域的序列，可将外源基因插入到prrsv基因组的任意位点，无需酶切消化，因此也就无需考虑片段上的酶切位点，更不用对基因组进行突变来满足酶切连接的需求，大大增加了全长cdna感染性克隆质粒的保真性，方便快捷。同时省去了酶切连接时存在的多步亚克隆步骤，将pcr扩增的prrsv基因组片段、插入外源基因的片段及载体片段等多个片段经一步反应即可获得全长cdna序列，阳性挑取率高，序列保真性好，省时省力。

45、(2)本发明选用pbr322载体作为基础载体，该载体具有拷贝数较低、稳定性好、外源基因容量大、质粒复制严谨性高等优点，大大降低了病毒基因组突变、缺失、基因重组和外源基因插入等情况的出现，提高了病毒cdna质粒在复制过程中的保真性，并且能够保证prrsv的大片段基因组序列在细菌中稳定保存。

46、(3)本发明以携带真核启动子(cmv启动子)的pbr322作为病毒拯救载体，只需将插入外源基因的重组prrsv全长cdna置于真核启动子之后，提取质粒，直接转染marc145，通过宿主细胞自身的转录酶系统在细胞内转录出prrsv全基因组rna，进而翻译出病毒所需的全部蛋白完成病毒核酸与蛋白的组装，最终获得拯救病毒。该方法不需要经过体外转录rna步骤，降低转染过程中rna降解的风险，不仅减少了试验操作的影响，也简化了整个试验流程，使转染的效率大大提高，极大提升了病毒拯救成功率。

47、(4)拯救稳定表达asfv p17蛋白的prrsv重组病毒可为进一步研制开发非洲猪瘟及其它猪病疫苗或疫苗组合奠定重要基础。