技术特征：
1.一套用于枳壳种质资源鉴定的snp分子标记，其特征在于：由4个snp标记组成，所述snp标记的具体信息如下：标记编号染色体snp物理位置等位基因型ci900011chr0122550627[t/a]ci900021chr0239351254[c/t]ci900025chr068158400[a/t]ci900018chr085774144[a/g]所述snp标记的物理位置是基于柚子参考基因组序列而确定的，所述柚子参考基因组序列在ncbi中的基因组版本号：ncbi genome assembly asm200692v1。2.根据权利要求1所述的用于枳壳种质资源鉴定的snp分子标记，其特征在于：所述枳壳种质资源为绿衣枳壳、香橙、臭橙、代代花。3.根据权利要求2所述的用于枳壳种质资源鉴定的snp分子标记，其特征在于：所述香橙为以绿衣枳壳为砧木嫁接的香橙，所述臭橙为以绿衣枳壳为砧木嫁接的臭橙；优选所述绿衣枳壳、香橙、臭橙、代代花均为江西地区的枳壳种质资源材料。4.用于扩增权利要求1至3任一项所述的snp分子标记的引物组合，其特征在于：包含特异性引物primer x、primer y和通用引物primer c；其中，用于扩增snp标记ci900011的引物组中primer x、primer y和primer c的核苷酸序列分别如seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7所示；用于扩增snp标记ci900021的引物组中primer x、primer y和primer c的核苷酸序列分别如seq id no.8、seq id no.9、seq id no.10所示；用于扩增snp标记ci900025的引物组中primer x、primer y和primer c的核苷酸序列分别如seq id no.11、seq id no.12、seq id no.13所示；用于扩增snp标记ci900018的引物组中primer x、primer y和primer c的核苷酸序列分别如seq id no.14、seq id no.15、seq id no.16所示。5.用于鉴定或辅助鉴定枳壳种质资源的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4所述的引物组合。6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，每一组引物中的特异性引物primer x和primer y的5’端分别带有荧光标签a序列和荧光标签b序列，所述荧光标签a序列和荧光标签b序列的核苷酸序列互不相同并且与枳壳基因组序列不同源；优选荧光标签a序列为fam荧光标签序列，荧光标签b序列为hex荧光标签序列。7.权利要求1至3任一项所述的snp分子标记或权利要求4所述的引物组合或权利要求5或6所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定枳壳种质资源，或者在枳壳种质资源基因分型中的应用。8.用于鉴定或辅助鉴定枳壳种质资源的方法，其特征在于：对待测枳壳样品进行snp分型检测，包括以下步骤：(1)提取待测枳壳样品的基因组dna；(2)采用权利要求3所述引物组合或者权利要求5或6所述的试剂盒对步骤(1)中提取的基因组dna进行snp多态性检测，根据基因型检测结果判断待测枳壳样品是否为权利要求2或3中所述的4份枳壳种质资源之一。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)是采用权利要求3所述的引物组合中的每一组引物分别对待测枳壳样品的基因组dna进行kasp扩增，荧光检测仪检测pcr产物，确定待测枳壳品种在每一组引物对应的snp分子标记位点的基因型，将检测结果与权利要求2或3中所述的4份枳壳种质资源的基因型进行比对，从而判断待测枳壳样品是否为权利要求2或3中所述的4份枳壳种质资源之一。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述kasp扩增的pcr的反应体系为0.8μl：含有样品dna 20ng-50ng，浓度为100μm的两条特异性引物各0.0013μl，浓度为100μm的通用引物0.0033μl，2
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kasp master mix 0.3945μl，超纯水0.3996μl；所述pcr的反应条件为：94℃预变性15min；第一步扩增反应，94℃变性20s，65℃～57℃退火并延伸60s，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20s，57℃退火并延伸60s，30个循环。
技术总结
本发明公开了一套用于枳壳种质资源鉴定的SNP分子标记，由4个SNP标记组成，所述SNP标记的物理位置是基于柚子参考基因组序列而确定的，所述柚子参考基因组序列在NCBI中的基因组版本号：ASM200692v1。还公开了用于扩增所述的SNP分子标记的引物组合及试剂盒，包含特异性引物Primer X、Primer Y和通用引物Primer C。还公开了它们的应用及鉴定或辅助鉴定枳壳品种的方法。本发明利用基于KASP反应原理及枳壳材料的单碱基差异设计的分子标记，可以对4份枳壳材料进行高通量的SNP分析检测和种质资源快速鉴定，结果准确性高，稳定性好，能够显著提高枳壳种质资源鉴定效率。提高枳壳种质资源鉴定效率。提高枳壳种质资源鉴定效率。
技术研发人员：杨光 李颖 陈美兰 张寿文 付孟娇 李应龙 贾佩陇 何国华 叶昌荣 陈杰 贾高峰 田冰川
受保护的技术使用者：中国中医科学院中药研究所
技术研发日：2022.07.25
技术公布日：2023/3/24