一株豆腐酸浆来源的植物乳杆菌及其应用

本发明涉及一株豆腐酸浆来源的植物乳杆菌及其应用，属于微生物以及食品加工。

背景技术：

1、豆腐作为一类中国特色的传统食品，从古至今一直深受人们的喜爱。不仅因为其美味可口，它还含有多种人体所需的必需氨基酸和非必需氨基酸，以及异黄酮、黄酮和维生素等生物活性成分，对人体有一定的保健作用。豆腐是以大豆为原料经过清洗、泡豆、磨浆、煮浆、凝固、压制、成型等多道工序制备而成。其中凝固是关键，凝固剂能够影响豆腐的微观结构、成型程度和均匀性。常用的豆腐凝固剂有石膏、盐卤、葡萄糖酸δ内酯(gdl)、酸浆等。其中以酸浆为凝固剂制备的酸浆豆腐是我国传统特色食品，在我国山东等地方具有特色的酸浆豆腐已经作为特色食品被列入“非物质文化遗产”。酸浆豆腐具有保水性好、质地细腻、营养价值高且含盐量低的特点。然而，由于酸浆是自然发酵的产物，受环境因素的影响较大，导致酸浆中菌群不稳定，酸浆豆腐质量不稳定、保质期短，尚未实现工业化生产。

2、尽管部分研究表明酸浆中优势微生物菌群为乳酸菌，也筛选出部分菌株，但对菌株的功能研究不够深入，仍停留在实验室阶段，尚未有能直接应用于工业化生产的直投式菌株。部分研究者将乳品发酵中工业化菌株移植至酸浆的制备，但存在菌株适应性较差、需要多菌株混合使用、发酵时间长、风味不正、获得的豆腐质地不理想等不足。因此从酸浆中筛选适合工业化纯种制备的酸浆专属性乳酸菌菌株，是实现酸浆摆脱目前手工作坊式生产，步入标准化、工业化生产首先要解决的问题。通过工业化纯种制备酸浆，不仅可以提高酸浆制备的效率，同时可以有效避免酸浆自然发酵引起的杂菌或致病菌污染带来的食品安全问题。

3、另一方面，乳酸菌作为人体肠道益生菌，食用安全性高，而且具有促进消化吸收、维持肠道菌群微生态平衡、免疫调节功能等多种益生作用。若能将乳酸菌直接接种至豆浆发酵制备发酵型豆腐，不仅可以减少酸浆制备的步骤，而且可以改变豆浆体系中的营养构成，实现豆腐品质的进一步提升。例如乳酸菌可利用糖类、矿物质等营养成分进行生长代谢，产生多种生物活性物质，改善发酵食品中营养物质的吸收和利用率，使发酵成品具有独特的风味和更高的营养价值；发酵过程中乳酸菌代谢生成的有机酸可直接诱导大豆蛋白的聚集凝固。这个过程中影响发酵豆腐品质的关键因素依然是菌株的特性，菌株的生长特性及代谢特性不仅会影响大豆蛋白的聚集性行为进而影响豆腐品质，而且会影响豆浆体系中原料物质的生物转化途径，进而影响豆腐的营养构成、风味特性等，因此筛选适合发酵豆腐制备的专属菌株尤为重要。尽管目前部分研究尝试了用乳酸菌发酵制备无凝固剂发酵豆腐这一工艺过程，但关于菌株对豆腐品质的研究不够深入，筛选同时满足适应性强、发酵快、豆腐风味和质地良好的菌种并非易事。

技术实现思路

1、为了解决目前存在的问题，本发明提供了一株豆腐酸浆来源的植物乳杆菌及其应用，具体的技术方案如下：

2、本发明提供一株豆腐酸浆来源的菌株sj-l-1，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏登记编号为cgmcc no.25209，保藏日期为2022年6月29日。

3、本发明提供的菌株sj-l-1的个体形态特征：杆状或短杆状，单个、成对或呈链状排列，革兰氏阳性。菌落形态特征：菌落正面类圆形，侧面稍有突起，乳白色或淡黄色，不透明，菌落边缘整齐，表面光滑，质地柔软有弹性。最适生长温度为37℃，最适ph为6.2-6.4。

4、本技术提供的菌株sj-l-1的生理生化学特征：能够利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、甘露醇等碳源，不能利用甘油、山梨糖、肌醇、淀粉、肝糖、木糖醇等碳源。不能水解吐温40，不能利用柠檬酸。能够利用葡萄糖醛酸、葡糖醛酰胺，不能利用丝氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、乙酰乙酸、丙酸、醋酸、甲酸、粘液酸、奎尼酸、d-葡糖二酸等。对洁霉素敏感，对万古霉素不敏感。

5、本技术提供的菌株sj-l-1的基因特征：与近型菌株戊糖乳杆菌(lactiplantibacilluspentosus)、植物乳杆菌(lactiplantibacillusplantarum)和阿根廷乳杆菌(lactiplantibacillus argentoratensis)的ddh值分别为24.20％、93.9％和63.40％；与近型菌株戊糖乳杆菌(lactiplantibacilluspentosus)、植物乳杆菌(lactiplantibacillus plantarum)和阿根廷乳杆菌(lactiplantibacillusargentoratensis)的ani值分别为82.11％、99.24％和95.56％；与植物乳杆菌的ddh值大于细菌物种的70％的阈值，ani值大于建议划界物种的95-96％的阈值，是一株植物乳杆菌。

6、通过形态学特征、生理生化特征和基因特征分析，菌株sj-l-1符合植物乳杆菌的特征。

7、本技术提供植物乳杆菌sj-l-1在直投发酵剂制备中的应用，包括以下步骤：

8、菌种活化后，37℃条件下在50ml锥形瓶中扩大培养24h，制备浓缩菌液，然后在菌体悬浮液中加入保护剂溶液，再将其真空冷冻干燥，最后保藏冷冻干燥所得的直投发酵剂。

9、上述步骤中，优选的，在制备缩菌液过程中，将培养好的菌液置于离心机中，8000×g，4℃条件下离心10min，用0.85％无菌生理盐水洗涤菌体两次。

10、上述步骤中，优选的，保护剂溶液为脱脂乳粉+5％蔗糖，菌液与保护剂比例(v/v)为1：1。

11、可选的，本技术提供的的植物乳杆菌sj-l-1在酸浆豆腐制备中的应用，包括以下步骤：

12、0.1-0.5g/l直投发酵剂或1-3％(体积百分比)菌种培养液的接种量将植物乳杆菌sj-l-1接入灭菌后的黄浆水。发酵10-15h酸浆ph即可降低至ph3.6-3.8，该ph范围的酸浆，在90℃下蹲脑至凝乳，蹲脑完成之后压制成型，可制备获得质地优良、风味独特、成品得率高的酸浆豆腐成品。

13、本技术还提供植物乳杆菌sj-l-1在无凝固剂发酵豆腐制备中的应用。

14、可选的，本技术提供的的植物乳杆菌sj-l-1在无凝固剂发酵豆腐制备中的应用，包括以下步骤：

15、(1)制备豆酪步骤：按0.1-0.5g/l直投发酵剂接种量将植物乳杆菌接种于灭菌后的豆浆中，30℃-35℃发酵20-26h形成豆酪；

16、(2)豆腐发酵：按1-3％(体积百分数)菌种培养液的接种量将豆酪接种于灭菌后的豆浆中，30℃-35℃发酵至ph分别为5.0-6.2。

17、(3)蹲脑温度的确定：豆浆发酵至ph5.0-6.2时，立即加热至75-95℃进行蹲脑。

18、上述步骤(1)中，优选的，植物乳杆菌以菌悬液的形式进行接种，接种量为3％。植物乳杆菌菌悬液的制备方法具体为：取-18℃保藏的植物乳杆菌甘油管，在无菌操作下接种到灭菌mrs液体培养基中，37℃培养24h，传代2次，得到植物乳杆菌菌悬液。

19、上述步骤(1)中，优选的，植物乳杆菌以直投发酵剂形式接种，接种量为0.2g/l。植物乳杆菌直投发酵剂制备方法具体为：保护剂溶液为脱脂乳粉+5％蔗糖，菌液与保护剂比例(v/v)为1：1，冷冻干燥获得直投发酵剂。

20、上述步骤(1)中，优选的，培养条件为：37℃恒温中发酵24h。

21、上述步骤(2)中，优选的，豆酪的接种量为3％。相对于低于3％的发酵量，3％的发酵量能在较短时间内达到所需的发酵结果；相对于3％的发酵量，高于3％的接种量，达到相同的发酵结果并没有明显优势。

22、上述步骤(2)中，优选的，培养条件为：37℃恒温中发酵至ph 5.8左右，豆浆处于半凝固状态，此时进行蹲脑，所得豆腐持水率高，质地最好；ph低于5.6时，豆浆处于完全凝固状态，经加热蹲脑后失水严重，质地发硬；ph高于6.0时，豆浆凝固不够充分，经加热蹲脑不能获得成型豆腐。

23、上述步骤(3)中，优选的，蹲脑温度为90℃。相对于75-85℃及95℃的蹲脑温度，在90℃的蹲脑温度下，豆腐的出品率更高。即，在豆浆品质和用量相同，且其他工艺条件步骤相同的情况下，相对于75-85℃及95℃的蹲脑温度，在90℃的蹲脑温度下所获得的豆腐的重量更高；也就是说豆腐的出品率更高。

24、有益效果

25、1、本发明中应用的植物乳杆菌sj-l-1为从众多酸浆乳酸菌中筛选出的适合酸浆制备及无凝固剂发酵豆腐制备的专属菌株，同时具有以下多方面优良性状，这是现有报道的菌株无法达到的。

26、2、本发明中应用的植物乳杆菌sj-l-1生长速度及产酸速度快、产酸能力强，在24h内产酸量为17.38g/l，对sj-l-1的生长条件进行优化，产酸量可进一步提高至26.01g/l。sj-l-1在黄浆水中发酵10-15h即可用于酸浆豆腐制备，而通常多菌种混合发酵黄浆水制备酸浆需要24h。通过sj-l-1纯种发酵，实现了单菌株短时间发酵，缩短生产周期，且避免多菌株混合发酵工艺不稳定的缺点；豆浆发酵4-6h即可达到发酵终点，用于无凝固剂发酵豆腐的生产，相比酸浆豆腐的生产周期，无凝固剂发酵豆腐因不需要单独酸浆制备的过程进一步缩短生产周期，节约成本。

27、3、本发明的植物乳杆菌sj-l-1耐冷冻能力强，通过菌液中添加的常规菌种保护剂，菌株存活率接近90％，活菌数可达到1.2×1012cfu/g，活菌数水平很高，可将其制备成高活力直投式发酵剂，具有操作方便，可实现连续生产，稳定性好等优点，为酸浆及无凝固剂发酵豆腐的标准化、工业化生产提供保障。

28、4、基于本发明的植物乳杆菌sj-l-1全基因组分析，该菌株碳水化合物代谢的基因在基因组中占比最大，通过cazy数据库注释共鉴定出13个与β-葡萄糖苷酶有关的基因。β-葡萄糖苷酶可以将异黄酮从糖苷型转化为生物活性较高的苷元型，从而提高大豆异黄酮的生物利用度。因此sj-l-1在黄浆水发酵及豆浆发酵过程中可有效将糖苷型异黄酮转化为生物利用度更高的苷元型，提高酸浆豆腐及无凝固型发酵豆腐的营养价值。

29、5、本发明的植物乳杆菌sj-l-1无凝固剂发酵豆腐的总异黄酮含量高，是卤水豆腐的3倍多，亦高于l-1-16发酵豆腐。sj-l-1发酵豆腐中的异黄酮从结合糖苷到苷元的转化率最高，提高了豆腐的营养功能价值。

30、6、本发明的植物乳杆菌sj-l-1基因组中具有合成抗菌肽的基因簇，且通过抑菌实验发现其能够产生抑菌物质，该性能是使得通过植物乳杆菌sj-l-1制备的酸浆具有天然抗菌性，进而可以使得纯种发酵酸浆制备的酸浆豆腐保质期比自然发酵酸浆制备的酸浆豆腐保质期长。

31、7、本发明的植物乳杆菌sj-l-1的抗菌特性使得sj-l-1无凝固剂发酵豆腐的保质期大于8天，l-1-16发酵豆腐的保质期约为6天，卤水豆腐、酸浆豆腐的保质期约为2天。

32、8、本发明的植物乳杆菌sj-l-1无凝固剂发酵豆腐具有硬度适中的特性，其硬度接近新鲜卤水豆腐的硬度，低于l-1-16发酵豆腐，但高于酸浆豆腐的硬度；且相比较l-1-16发酵豆腐，sj-l-1发酵豆腐的结构更均匀。

33、9、本发明的植物乳杆菌sj-l-1无凝固剂发酵豆腐质构稳定性高，优于卤水豆腐及酸浆豆腐。卤水豆腐及酸浆豆腐的硬度在第4天时明显下降，此时卤水豆腐及酸浆豆腐已经发生变质。l-1-16发酵豆腐的硬度在第8天时明显下降，相比之下，植物乳杆菌发酵豆腐在第8天时硬度仍然无显著差异性。

34、10、本发明的植物乳杆菌sj-l-1无凝固剂发酵豆腐的风味物质总量高。

35、11、纯种乳酸菌发酵，无杂菌等致病菌污染，提高了生产速度并保证了豆腐食用安全性。