ODC基因的缺失在获得浓香型水稻中的应用

本发明属于作物育种、作物品质改良、新种质创制领域，具体涉及odc基因的缺失在获得浓香型水稻中的应用，尤其涉及基于crispr/cas9技术或杂交技术快速获得浓香型水稻的方法。

背景技术：

1、大米，作为全球一半以上的人口的主食，全球粮食安全在很大程度上依赖于大米的产量。香气是大米的一个重要属性，随着时代的发展，消费者关注点更倾向于外观、香气、口感等特征属性。世界各地对香米的需求日益增长，引起了稻米生产商的注意，并促使他们将提高稻米的香味作为改进其商业稻米品种的主要目标。

2、2-乙酰-1-吡咯啉(2-acetyl-1-pyrroline；2-ap)是香味大米的主要物质。2-ap赋予香米爆米花般的香味，将香米和非香米进行比较时发现，在香味大米中发现的2-ap含量至少是非香味大米的15倍。水稻中的甜菜碱醛脱氢酶同源物2(badh2)，是一个与香味相关的基因。一些具有香味的水稻品种在该基因在7号外显子中有1个8bp的缺失，其功能的丧失会引起2-ap的积累从而导致香味的产生。目前水稻大规模基因组测序，为通过全基因关联分析(gwas)方法寻找新基因提供了基础。我们对水稻地方品种的全基因组测序数据分析发现一个新的调控水稻香味的基因odc，该基因编码鸟氨酸脱羧酶，在一些具有浓香型的水稻品种中，该基因在编码区存在22bp的缺失，因此该基因的功能丧失，从而导致水稻的香味增加。

3、基因组编辑技术是一种在基因组水平上对dna序列进行靶向修饰的遗传操作技术。crispr/cas9系统是近几年发展起来的一类基因编辑技术系统。该系统通过非编码rna识别靶点，利用rna和dna之间互作来进行靶基因的锚定，形成的非编码rna和cas蛋白的复合物则会切割相应的基因位点。目前，crispr/cas9系统作为新的基因定点编辑工具，其构成简单、成本低、快速且高效，已广泛应用于农作物的基因编辑中。随着基因编辑技术的快速发展，crispr/cas9技术在水稻基因功能研究方面有了长足的进步。采用crispr/cas9技术编辑水稻基因组，改变水稻各种农艺性状，已不再是不可逾越的技术障碍。过去几十年中，传统的突变体筛选和分子辅助育种为水稻生产做出了巨大的贡献。然而目前，水稻生产面临着诸多的新挑战，如人口快速增长，全球气候变化以及由此衍生的新的病虫害及其他环境问题。因此迫切需要更先进的技术和方法，来创制水稻新品种，使其具有更高的产量和更好的品质。因此，我们利用基因编辑技术或杂交技术，对新的香味调控基因odc进行编辑，来获得一些浓香型的水稻新种质。

技术实现思路

1、发明目的：本发明意料之外的发现odc基因的缺失能够获得浓香型水稻中的应用，该odc基因可以控制水稻香味，该基因编码鸟氨酸脱羧酶，该基因序列的缺失导致编码蛋白的功能缺失会使水稻产生香味。基于这样的思路，本发明一方面所要解决的技术问题是通过基因编辑的方法缺失该odc基因从而获得了浓香型水稻，本发明另一方面所要解决的技术问题是通过采用odc缺失的水稻品种与香味型水稻品种进行杂交的方法获得了浓香型水稻。

2、本发明最后要解决的技术问题是获得了能够鉴定odc基因缺失的分子标记从而能够用于鉴定浓香型的水稻品种。

3、技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种获得浓香型水稻的方法，所述方法包括：下调水稻的鸟氨酸脱羧酶的表达或活性，所述鸟氨酸脱羧酶的核苷酸序列如seq id no：25所示。

4、其中，所述的下调水稻的鸟氨酸脱羧酶的表达或活性的方法包括：在水稻的基因组中敲除或沉默odc基因；或下调odc基因转录、多肽表达或多肽活性的下调剂转入水稻中，或采用odc缺失的水稻品种与香味型水稻品种进行杂交。

5、其中，所述的下调剂为特异性干扰odc基因表达的干扰分子，所述的干扰分子为抑制或沉默odc基因或其转录本的dsrna、反义核酸、小干扰rna、微小rna、sgrna，或能表达或形成所述dsrna、反义核酸、小干扰rna、微小rna的构建物。

6、其中，下调后的水稻的odc基因的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.3所示，下调后的水稻的鸟氨酸脱羧酶的氨基酸序列如seq id no.2或seq id no.4所示。

7、本
技术实现要素：
还包括基于crispr/cas9技术快速获得浓香型水稻的方法，所述方法为设计用于编辑odc基因的sgrna识别位点的靶序列，将其构建crispr/cas9-odc基因编辑载体，将该载体转化水稻获得浓香型水稻。

8、其中，所述的sgrna识别位点的靶序列为5’-tgttcgcggcgtggtggcgc-3’(seq idno.5)或5’-cgccgagcagcgccgggttg-3’(seq id no.6)。

9、其中，所述crispr/cas9-odc基因编辑载体的构建方法如下：

10、(a)靶点接头的制备：将接头引物对odc spacer1 f和odc spacer1 r混合高温变性后退火，即获得靶点接头odc spacer1；同样，将将接头引物对odc spacer2 f和odcspacer2 r混合高温变性后退火，即获得靶点接头odc spacer2；

11、(b)sgrna连接产物的制备：采用pylsgrna-osu3中间载体、靶点接头odc spacer1、dna连接酶、bsai进行连接反应获得sgrna1连接产物；采用同样的方法连接靶点接头odcspacer2，得到sgrna2连接产物；

12、(c)扩增sgrna的表达盒：分别以引物组合1和引物组合2对sgrna1连接产物进行第一轮pcr扩增获得第一轮pcr产物1和第一轮pcr产物2，然后以扩增引物对1对第一轮pcr产物1和第一轮pcr产物2进行第二轮pcr，获得的pcr产物即为sgrna1表达盒；以同样的方法对sgrna2连接产物进行第一轮pcr扩增获得第一轮pcr产物3和第一轮pcr产物4，然后以扩增引物对2对第一轮pcr产物3和第一轮pcr产物4进行第二轮pcr，获得的pcr产物即为sgrna2表达盒；

13、(d)将sgrna1表达盒和sgrna2表达盒连接到crispr/cas9表达载体上，获得连接产物；

14、(e)将步骤(d)的连接产物进行热激转化大肠杆菌获得重组菌，提取含有目的条带的阳性质粒。

15、其中，所述步骤(a)所用接头引物对包括odc spacer f1和odc spacer r1；或odcspacer f2和odc spacer r2，具体的接头引物对序列如下：

16、odc spacer f1：ggcatgttcgcggcgtggtggcgc；seq id no.7

17、odc spacer r1：aaacgcgccaccacgccgcgaaca；seq id no.8

18、odc spacer f2：gttgcgccgagcagcgccgggttg；seq id no.9

19、odc spacer r2：aaaccaacccggcgctgctcggcg；seq id no.10

20、其中，所述步骤(c)所用引物组合1为正向引物ctccgttttacctgtggaatcg(seq idno.11)和靶标序列1接头反向引物：aaacgcgccaccacgccgcgaaca(seq id no.8)或靶标序列2反向引物：aaaccaacccggcgctgctcggcg(seq id no.10)，所述引物组合2为反向引物：cggaggaaaattccatccac(seq id no.12)和靶标序列1接头正向引物：ggcatgttcgcggcgtggtggcgc(seq id no.7)或靶标序列2接头正向引物：gttgcgccgagcagcgccgggttg(seq id no.9)；

21、其中，所述步骤(c)扩增引物对1为uctcg-b1’和grcggt-b2，所述扩增引物对2为uctcg-b2’和grcggt-bl；

22、uctcg-b1’：ttcagaggtctctctcgactagtggaatcggcagcaaagg(seq id no.13)

23、grcggt-b2：agcgtgggtctcgtcagggtccatccactccaagctc(seq id no.14)

24、uctcg-b2’：ttcagaggtctctctgacactggaatcggcagcaaagg(seq id no.15)

25、grcggt-bl：agcgtgggtctcgaccgacgcgtccatccactccaagctc；(seq id no.16)

26、其中，所述方法包括将所获得的含有目的条带的crispr/cas9基因编辑载体转入农杆菌eha105中，转化水稻(绥粳18水稻)，获得t0代转基因植株，以扩增引物对3对t0代转基因植株进行扩增并测序鉴定获得odc缺失突变的植株。

27、其中，所述扩增引物对3为5’-cagaagcagaaatccatggcag-3’(seq id no.17)和5’-tggttcccaagtttagcatggc-3’(seq id no.18)。

28、其中，所述方法还包括将含有odc基因突变的t0代转基因植株，自交后的t1代植株的t-dna载体的剔除，所述t-dna载体包括潮霉素磷酸转移酶基因hpt、核酸酶基因cas9和sgrna编码基因。

29、其中，所述t-dna载体的剔除通过对含有odc基因突变的t1代植株的hpt基因、cas9基因和sgrna编码基因同时检测，重复多次，筛选得到不携带这三个基因的t1代单株即为目标植株。

30、其中，hpt基因检测方法通过以odc基因突变的t1代植株的基因组dna为模板，以引物35s-ntf1和引物hyg-tr2进行pcr扩增，同时，cas9基因检测方法通过以odc基因突变的t1代植株的基因组dna为模板，以引物ubi-f1-new和引物cl-r2-new进行pcr扩增，当均未同时检测到hpt基因、cas9基因，表明成功剔除了t-dna。

31、其中，所述引物35s-ntf1：5’-acaatcccactatccttcgcaag-3’(seq id no.19)，引物hyg-tr2：5’-gtacttctacacagccatcggtc-3’(seq id no.20)，所述引物ubi-f1-new：5’-tttccccaacctcgtgttgttc-3’(seq id no.21)，引物cl-r2-new：5’-gaggttcttcttgatggagtgg-3’(seq id no.22)，引物odc-f2：5’-cagaagcagaaatccatggcag’(seq id no.17)，引物odc-r3：5’-tggttcccaagtttagcatggc-3’(seq id no.18)。

32、作为本发明的实施方式之一，本发明还提供了一种利用基因编辑crispr/cas9技术快速获得香味水稻的方法，所述方法为设计用于编辑odc基因的sgrna识别位点的靶序列，将其构建crispr/cas9-odc基因编辑载体，将该载体转化水稻获得无t-dna的香味水稻。

33、作为本发明的实施方式之一，本发明还提供了鉴定odc缺失的分子标记，所述分子标记为odc-m1f和/或odc-m1r，odc-m1f的碱基序列为5’-ttaccggactcgtgcggaccat-3’(seqid no.23)，所述odc-m1r的碱基序列为5’-atcttgccgacctcctcctcg-3’(seq id no.24)。

34、本发明内容还包括所述的鉴定odc缺失的分子标记在鉴定浓香型水稻品种中的应用。

35、其中，所述采用odc缺失的水稻品种与香味型水稻品种进行杂交的方法中，所述odc缺失的水稻品种为odc基因编辑植株，所述香味型水稻品种为badh2缺失的水稻品种。

36、有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：

37、1)本发明首次找到控制水稻香味的新型基因odc，该基因编码鸟氨酸脱羧酶，该基因序列的缺失可以导致功能的丧失，从而使水稻产生香味。

38、2)本发明通过基因编辑crispr/cas9的技术快速获得浓香型水稻的方法。该方法简单易操作，便捷快速，可以快速获得无t-dna的香味水稻。

39、3)本发明的获得odc突变的基因编辑绥粳18水稻，香味物质2-ap含量较没有突变的绥粳18水稻2-ap含量提高了1倍。