一种IV型CRISPR-Csf复合物、载体系统

一种iv型crispr-csf复合物、载体系统
技术领域
1.本发明涉及基因编辑技术领域，特别涉及一种iv型crispr-csf复合物、载体系统。


背景技术：

2.根据效应复合物中cas蛋白的组分，crispr-cas复合物大体可以分为两大类：class1(包含i、iii和iv型)和class 2(包含ii、v和vi型)。class 1中的效应复合物由多种cas蛋白组成，而class 2中的效应复合物仅含单个cas蛋白。前面鉴定的class1系统需要递送的基因size较大，不利于递送。因此，目前class2系统由于size更小，利于递送。目前广泛应用的class2 crispr-cas9以及crispr-cpf1系统虽然仅有一个蛋白组分，但是需要递送的基因较大，例如应用最广泛的crispr-spcas9需要递送4104bp基因来表达spcas9蛋白，递送比较困难。
3.目前应用最广泛的dna靶向的基因编辑技术是crispr-cas9和crispr-cas12a基因编辑系统，二者在识别dna的过程中均需要在靶向基因位点上存在某个较短的dna序列，即pam序列(protospacer adjacent motif,pam)。例如目前应用广泛的crispr-cas9系统识别富含鸟嘌呤pam序列(ngg)，而crispr-cas12a系统倾向识别富胸腺嘧啶的pam序列(如ttn)。虽然二者相互补足，但是仍然存在识别基因组覆盖不足的缺点。因此，开发新型基因编辑系统，拓展基因编辑的范围仍然是一个非常热门的方向，可以延伸基因编辑工具在诸多领域中的应用。
4.因此，现有技术还有待于改进和发展。


技术实现要素：

5.鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种iv型crispr-csf复合物、载体系统，旨在解决现有基因编辑系统仍然存在递送基因较大、识别基因组覆盖不足的问题。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种iv型crispr-csf复合物，其中，由crrna以及结合在所述crrna上的iv型crispr-csf效应蛋白组成，所述crrna包含能够杂交到靶dna序列上的指导序列。
8.所述的iv型crispr-csf复合物，其中，所述iv型crispr-csf效应蛋白包括csf1分子、csf2分子、csf3分子以及csf5分子中的一种或多种。
9.所述的iv型crispr-csf复合物，其中，所述指导序列为杂交到真核细胞或原核细胞的靶dna序列。
10.所述的iv型crispr-csf复合物，其中，所述靶dna序列为pam序列，所述pam序列是dwn，其中，d是a、t或g；w是a或t；n是a，t，g或c。
11.一种用于提供所述iv型crispr-csf复合物的载体系统，其中，所述载体系统包括一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：
12.第一调控元件，所述第一调控元件与编码所述iv型crispr-csf效应蛋白的核苷酸
序列可操作地连接；
13.以及第二调控单元，所述第二调控元件与编码所述crrna的核苷酸序列可操作地连接。
14.所述的载体系统，其中，所述一种或多种载体包含病毒载体。
15.一种递送粒子，其中，包含本发明所述的iv型crispr-csf复合物。
16.所述的递送粒子，其中，还包括脂质、糖、金属或蛋白质。
17.一种iv型crispr-csf复合物的构建方法，其中，包括步骤：
18.合成绿脓杆菌iv型基因簇的csf1-csf5基因以及crispr基因；
19.将csf3基因克隆至prsfduet载体上，得到csf3-prsfduet质粒；将连接strep-ii亲和标签的csf5基因及crispr基因分别克隆至petduet-1载体的前后两个多克隆位点上，得到csf5-crrna-petduet质粒；将csf2基因及带有组氨酸亲和标签的csf1基因分别克隆至pcdfduet-1载体的两个多克隆位点上，得到csf2-csf1-pcdfduet质粒；
20.将所述csf3-prsfdue，csf5-crrna-petduet，csf2-csf1-pcdfduet不同抗性三个质粒同时转化至感受态的bl21-ril大肠杆菌中，转移至lb液体培养基中进行振荡过夜培养，所述lb液体培养基中包括卡那霉素，氨苄青霉素，链霉素以及氯霉素，获取成功转化了上述三个质粒的转化后大肠杆菌菌液；
21.将所述转化后大肠杆菌菌液转接到含有卡那霉素，氨苄青霉素，链霉素以及氯霉素的新鲜lb液体培养基中进行培养后，通过离心收集细胞，用破碎缓冲液对收集的细胞重悬后冻存，得到细胞重悬液；
22.将所述细胞重悬液解冻后加入破碎缓冲液混匀，进行超声破碎，将破碎后的混合物进行离心，取上清液进行洗脱、纯化处理，获得所述crispr-csf复合物。
23.所述iv型crispr-csf复合物的构建方法，其中，所述细胞重悬液的制备具体包括步骤：
24.将所述转化后大肠杆菌菌液转接到含有卡那霉素，氨苄青霉素，链霉素以及氯霉素的新鲜lb液体培养基中，振荡培养后加入iptg继续振荡培养，诱导相应蛋白表达；
25.通过离心收集细胞，用破碎缓冲液对收集的细胞重悬后冻存，得到细胞重悬液，所述破碎缓冲液包括tris 8.0，nacl以及dtt。
26.有益效果：本发明制备了一种iv型crispr-csf复合物，表达该系统需要的基因片段较小，易于递送；该系统可在细胞内表达并成熟组装，可鉴定新型的pam序列，扩展了crispr系统的识别dna范围；且该系统由多个蛋白组成，可以在多个蛋白上偶联效应蛋白，加强信号，实现基因的成像，转录调控，单碱基编辑，表观遗传修饰等；进一步地，该系统特异性地存在于质粒上，可以靶向耐药质粒，用于制备治疗耐药菌感染疾病的药物。
附图说明
27.图1为本发明一种iv型crispr-csf复合物的构建方法流程图。
28.图2为本发明一种iv型crispr-csf复合物的基因簇图谱。
29.图3为本发明iv型crispr-csf复合物的分子筛纯化图谱。
30.图4为本发明iv型cirpsr-csf复合物直接结合靶dsdna的电泳结果图。
31.图5为本发明iv型cirpsr-csf复合物的结构解析图。
32.图6为本发明通过突变靶dna上的pam序列，鉴定iv型cirpsr-csf复合物识别靶dna的
‘
dwn’pam序列的原理图。
具体实施方式
33.本发明提供一种iv型crispr-csf复合物、载体系统，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
34.请参阅图1，图1为本发明提供的一种iv型crispr-csf复合物的构建方法，如图所示，其包括步骤：
35.s10、合成绿脓杆菌iv型基因簇的csf1-csf5基因以及crispr基因；
36.s20、将csf3基因克隆至prsfduet载体上，得到csf3-prsfduet质粒；将连接strep-ii亲和标签的csf5基因及crispr基因分别克隆至petduet-1载体的前后两个多克隆位点上，得到csf5-crrna-petduet质粒；将csf2基因及带有组氨酸亲和标签的csf1基因分别克隆至pcdfduet-1载体的两个多克隆位点上，得到csf2-csf1-pcdfduet质粒；
37.s30、将所述csf3-prsfdue，csf5-crrna-petduet，csf2-csf1-pcdfduet不同抗性三个质粒同时转化至感受态的bl21-ril大肠杆菌中，转移至lb液体培养基中进行振荡过夜培养，所述lb液体培养基中包括卡那霉素，氨苄青霉素，链霉素以及氯霉素，获取成功转化了上述三个质粒的转化后大肠杆菌菌液；
38.s40、将所述转化后大肠杆菌菌液转接到含有卡那霉素，氨苄青霉素，链霉素以及氯霉素的新鲜lb液体培养基中进行培养后，通过离心收集细胞，用破碎缓冲液对收集的细胞重悬后冻存，得到细胞重悬液；
39.s50、将所述细胞重悬液解冻后加入破碎缓冲液混匀，进行超声破碎，将破碎后的混合物进行离心，取上清液进行洗脱、纯化处理，获得目的蛋白，即crispr-csf复合物。
40.本实施例制备了一种iv型crispr-csf复合物，表达该系统需要的基因片段较小，易于递送；该系统可在细胞内表达并成熟组装，可鉴定新型的pam序列，扩展了crispr系统的识别dna范围；且该系统由多个蛋白组成，可以在多个蛋白上偶联效应蛋白，加强信号，实现基因的成像，转录调控，单碱基编辑，表观遗传修饰等；进一步地，该系统特异性地存在于质粒上，可以靶向耐药质粒，用于制备治疗耐药菌感染疾病的药物。
41.在一些实施方式中，还提供一种iv型crispr-csf复合物，其由crrna以及结合在所述crrna上的iv型crispr-csf效应蛋白组成，所述crrna包含能够杂交到靶dna序列上的指导序列；所述iv型crispr-csf效应蛋白包括csf1分子、csf2分子、csf3分子以及csf5分子中的一种或多种。
42.在本实施例中，所述指导序列为杂交到真核细胞或原核细胞的靶dna序列。所述靶dna序列为pam序列，所述pam序列是dwn，其中，d是a、t或g；w是a或t；n是a，t，g或c。
43.在一些实施方式中，所述iv型crispr-csf效应蛋白上偶联上一些功能分子来发挥功能，比如偶联一个激活因子或者抑制因子，从而发挥crispri或者crispra的作用。
44.在一些实施方式中，还提供一种用于提供所述iv型crispr-csf复合物的载体系统，其中，所述载体系统包括一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：第一调控元件，所述第一调控元件与编码所述iv型crispr-csf效应蛋白的核苷酸序列可操作地连接；以及第
二调控单元，所述第二调控元件与编码所述crrna的核苷酸序列可操作地连接。
45.在本实施例中，所述一种或多种载体包含病毒载体。作为举例，所述病毒载体可以为逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。
46.在一些实施方式中，还提供一种递送粒子，其包含本发明所述的iv型crispr-csf复合物。在本实施例中，所述递送粒子还包含递送媒介，所述递送媒介包含脂质、糖、金属和蛋白质中的一种。
47.在一些实施方式中，还提供一种iv型crispr-csf复合物的应用，其中，将本发明所述iv型crispr-csf复合物用于制备治疗耐药菌感染疾病的药物。
48.下面通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明：
49.实施例1
50.1、type iv-a crispr-csf复合物表达质粒构建，将不同的基因构建到不同的表达载体上：
51.首先在上海生工合成如图2所示p.aeruginosa(绿脓杆菌)iv型基因簇的csf1-csf5基因以及crispr基因，并分别将不同的基因构建到不同抗性的表达载体上，其中，将csf3基因克隆至prsfduet载体上(卡那抗性)，得到cas5-prsfduet质粒；将连接strep-ii亲和标签的csf5基因及crispr基因分别克隆至petduet-1载体(氨苄抗性)的前后两个多克隆位点上，得到cas6-crrna-petduet质粒；将csf2基因及带有组氨酸亲和标签的csf1基因分别克隆至pcdfduet-1载体(链霉素抗性)的两个多克隆位点上，得到cas7-cas8-pcdfduet质粒；在csf4基因前加入sumo标签，并加入ulp1酶切位点，将其作为一个整体克隆到prsfduet载体上(卡那抗性)。
52.2、type iv-a crispr-csf复合物体外表达组装：
53.将cas5-prsfduet，cas6-crrna-petduet，cas7-cas8-pcdfduet不同抗性三个质粒同时转化至bl21-ril大肠杆菌感受态中，转移至lb液体培养基，将成功转入三种抗性质粒的大肠杆菌(耐受30mg/ml卡那霉素，50mg/ml氨苄青霉素，50mg/ml链霉素，34mg/ml氯霉素)震荡过夜。将过夜培养的菌液转接到含相应抗生素的新鲜lb液体培养基进行大量培养，37℃振荡培养至od600至0.8后，加入0.5mm iptg，16℃振荡培养20小时，诱导相应蛋白表达。低温培养20小时后通过离心收集细胞，用破碎缓冲液(20mm tris 8.0,300mm nacl,1mm dtt)重悬后冻存。
54.3、type iv-a crispr-csf复合物的纯化(双标签纯化,his和strep标签)：
55.将细胞重悬液解冻，再加入约50ml破碎缓冲液后混匀，进行超声破碎，将破碎后的混合物进行高速离心，取其中的上清液加入到事先已用破碎缓冲液平衡的镍胶重力柱中，利用重力作用使其自然流下，再依次加入不同浓度咪唑缓冲液去除杂蛋白，最后利用高浓度的咪唑缓冲液(500mm)可将结合在镍柱上的目的蛋白洗脱下来。将含有目的蛋白的咪唑缓冲液透析至低盐缓冲液(20mm tris 8.0,100mm nacl,1mm dtt)后，再次进行strep柱亲和层析，用10个柱体积的低盐缓冲液去除杂蛋白后，加入10mm脱硫生物素将目的蛋白洗脱下来。随后，将目的蛋白混合液加入到阴离子交换柱后，利用nacl梯度将目的蛋白洗脱下来，收集目的蛋白，浓缩至体积约1ml，利用分子筛亲和层析进行进一步纯化，收集目的蛋白峰，浓缩。
56.通过镍亲和层析、分子排阻层析等一系列纯化条件的摸索，得到了状态均一的复
合物，并且发现csf1、csf2、csf3、csf5与crrna可以形成稳定复合物(csf
crrna
复合物)；接着添加不同的底物，通过冷冻电镜以及晶体衍射技术解析了iv-a型crispr-csf系统在执行功能时的一些列复合物。
57.通过纯化鉴定，成功体外组装表达crispr-csf复合物，其包含csf1,csf2,csf3，csf5以及crrna，如图3所示。
58.实施例2
59.iv型crispr-csf复合物与靶dsdna的结合测试：
60.利用电泳凝胶迁移(electrophoretic gel mobility shifts，emsa)来检测实施例1制得的crispr-csf复合物是否可以直接结合dsdna。
61.将双链dna中的一条链的5’端标记羧基荧光素6-fam，凝胶电泳后通过分子成像仪检测蛋白-dna结合情况。通过上海生工公司合成带有6-fam标记的ssdna以及不带标记的互补链，将两条ssdna退火成带有6-fam标记的dsdna，终浓度为1μm。emsa反应中固定dna探针浓度为50nm，设置不同的蛋白浓度梯度。将dna探针与蛋白加入到结合缓冲液(10mm hepes,75mm nacl,75mm kcl,5mm mgcl2,100μm cocl2,ph 7.5)中37℃孵育60分钟后利用native-page进行验证，结果如图4所示。
62.实施例3
63.iv型crispr-csf复合物的结构解析
64.对实施例1制得的iv型crispr-csf复合物利用冷冻电镜技术进行结构解析，结果如图5所示。通过结构解析可以发现，crispr-csf复合物的组分包含1个分子csf1,5个分子csf2,1个分子csf3以及1个分子的csf5以及成熟的crrna分子。crispr-csf复合物可以通过共同表达csf1,csf2，csf3以及csf5和crispr序列，通过csf5对crrna的前体进行切割，形成成熟的crrna,然后与各个蛋白组分组装成成熟的有功能的复合物，完成接下来的dna识别工作。简而言之，就是通过结构解析，本实施例找到了一种可以体外表达有功能的crispr-csf复合物的方法。
65.通过结构的解析，本实施例首次鉴定了crispr-csf复合物的组分和比例，也成功体外组装，本实施例发现行使功能的复合物的表达基因的size较小，甚至比现在广泛应用的cas9的基因size还小，仅需3,159bp基因就可以表达crispr-csf复合物,在递送方面非常有优势，具有非常巨大的应用价值。
66.通过结构的解析，本实施例还鉴定了该复合物可以靶向结合dsdna。根据解析的结构将不同的效应蛋白链接到本实施例复合物中不同的蛋白上，而且可以多个连接，效应增强，从而可实现dna的成像，dna转录调控，dna的表观遗传学修饰等。
67.实施例4
68.鉴定了crispr-csf复合物识别靶dna的
‘
dwn’pam序列(d is a,tor g；w is a or t；n is a,t,g or c)
69.通过突变靶dna上的pam序列，然后通过emsa实验验证亲和力，我们鉴定了相应的pam(原型间隔区相邻基序)序列，如图6所示。例如，目前应用最广泛的cas9的识别需要在dna上存在ngg的pam序列。如果没有该pam序列，cas9就无法识别dna无法完成编辑。因此，本实施例发现了crispr-csf复合物可以识别“dwn”的新的pam序列，使得更广泛的dna可以识别并编辑。
70.综上所述，本发明制备的iv型crispr-csf复合物包含csf1,csf2，csf3以及csf5多个蛋白，可以在多个位置连接其他效应蛋白，在基因的转录调控、表观遗传调控以及基因成像等方面具有独特的优势；crispr-cas9中包含的sgrna需要在体内终止转录sgrna,而本发明crispr-csf复合物可以自己加工crrna,使其成熟；与其他类型crispr-cas系统明显不同的是，本发明提供的iv型crispr-csf复合物主要存在于细菌的质粒上而并非染色体上，并且对同一宿主的其他质粒具有很强的靶向性，可以介导宿主中不同质粒之间的竞争，细菌iv-a型crispr-csf系统被证实具有靶向对抗携带耐药基因质粒的能力，因而具有应用于耐药菌感染治疗的潜力；本发明提供的iv型crispr-csf复合物可鉴定一种新型的pam序列，扩展了crispr系统的识别dna范围；表达本发明iv型crispr-csf复合物需要的基因片段较小，仅需3,159bp,易于递送。
71.应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。