克服着床前和着床后表观遗传障碍的体细胞核移植技术

本发明涉及生物遗传领域。具体地说，本发明涉及克服着床前和着床后表观遗传障碍的体细胞核移植技术。

背景技术：

1、体细胞核移植技术(somatic cell nuclear transfer,scnt)是指通过显微操作技术将终末分化的体细胞核注射到去核的卵母细胞中，这样形成的重组胚胎最终发育成个体的技术，也称为体细胞克隆技术。体细胞细胞核拥有完整的基因组dna序列，因此体细胞核移植胚胎发育效率低的主要原因是不依赖于dna序列的表观遗传异常。

2、体细胞核移植技术能够将终末分化的体细胞重编程为具有全能性的胚胎。因此，体细胞核移植技术介导的哺乳动物克隆技术对于农业畜牧生产、濒危动物的物种保护、药物生产、疾病模型构建以及再生医学有着巨大的潜在应用价值。截止目前，已有超过20种哺乳动物被克隆出来，包括非人灵长类。然而，极低的克隆效率严重限制这一技术的应用，例如，小鼠核移植效率在不应用表观修饰手段的情况下只有1％。

3、过去的研究发现小鼠体细胞核移植胚胎中主要存在两类表观障碍。一类是着床前表观障碍导致合子基因组激活(zygotic genome activation,zga)失败，包括h3k9me3异常、h3k4me3异常以及组蛋白乙酰化异常。另一类是由h3k27me3介导的非典型母源印记丢失导致的着床后表观障碍。

4、克隆胚胎拥有与正常受精胚胎相同的dna序列。因此，克隆胚胎的发育异常大多数是由于不依赖dna序列的表观遗传缺陷造成的。之前已经有许多研究发现克隆胚胎中h3k9me3、h3k4me3和组蛋白乙酰化的异常会导致合子基因组激活失败，影响克隆胚胎的着床前发育。在小鼠核移植胚胎中通过添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂tsa、过表达kdm4d或者kdm4b解决h3k9me3障碍以及过表达kdm5b去除h3k4me3障碍都能够显著提高着床前发育和提升核移植效率。重要的是，联合kdm4d过表达和tsa处理或者联合注射kdm4b和kdm5b都能够使核移植胚胎的囊胚率与正常受精胚胎类似。

5、体细胞核移植胚胎的着床后发育异常包括克隆胚胎的x染色体失活异常和h3k27me3母源印记丢失。在正常小鼠着床前胚胎发育过程中，xist作为x染色体失活的主要调控者，覆盖于父本的x染色体上，使其失活，而母本的x染色体则保持活性，这一x染色体失活方式称为x染色体的印记失活。然而，在克隆小鼠胚胎中xist的异常表达导致雌性胚胎中两条x染色体或者雄性胚胎中x染色体处于失活状态。在其后的研究中发现小鼠核移植胚胎中xist是由h3k27me3母源印记所调控的。已经有研究发现h3k27me3母源印记基因sfmbt2、jade1、gab1、smoc1、slc38a4和gm32885对核移植胚胎着床后发育至关重要，尤其是对克隆胎盘的发育。通过构建杂合敲除的xist供体细胞模拟正常胚胎中的xci能够显著提升小鼠核移植效率。联合过表达kdm4d和xist敲除能够将小鼠核移植效率最高提升到23.5％，但是这些克隆动物依然存在着床后发育问题，包括异常增大的胎盘，胎盘中海绵层和迷路层不规则的边界以及膨胀的海绵层细胞。然而，通过修正克隆胚胎中的h3k27me3母源印记基因sfmbt2、jade1、gab1和smoc1能够挽救异常的克隆胎盘以及将成纤维细胞的克隆效率从0％提升至14％。

6、在单个核移植胚胎中解决大多数的表观障碍依然是目前研究的难点，特别是在供体细胞中引入多个杂合敲除的h3k27me3母源印记基因从而模拟正常胚胎中h3k27me3母源印记是非常具有难度的。现有技术中克服h3k27me3印记障碍的方法是通过杂合敲除多个h3k27me3母源印记基因，这一方法依赖基因编辑可能会导致基因组的不稳定性，并且这一方法操作难度很大，需要构建单倍体胚胎干细胞以及利用四倍体补偿技术，最终获得的存活个体也非常稀少。

7、然而，如何在单个胚胎中克服目前已知的多个表观遗传障碍仍然是个难题。因此，本领域需要开发一种高效且简便的体细胞核移植技术体系。

技术实现思路

1、本发明的目的就是提供克服着床前和着床后表观遗传障碍的体细胞核移植技术。

2、在本发明的第一方面，提供了一种体细胞克隆非人哺乳动物制备方法，包括步骤：

3、(i)提供一体细胞核移植胚胎；

4、(ii)对所述核移植胚胎进行激活和重编程处理，培养得到经处理的胚胎；

5、(iii)从所述经处理的胚胎中分离内细胞团，与四倍体胚胎细胞聚合得到内细胞团-四倍体聚合胚胎；和

6、(iv)将所述聚合胚胎进行移植，从而获得所述体细胞克隆非人哺乳动物。

7、在另一优选例中，所述的步骤(i)中，所述体细胞核移植胚胎通过以下步骤得到：提供一正常未受精卵，将体细胞核注入所述未受精卵，培养得到所述体细胞核移植胚胎。

8、在另一优选例中，步骤(ii)中，进行激活处理的核移植胚胎处于1细胞期。

9、在另一优选例中，所述的激活为使用激活处理剂进行激活。

10、在另一优选例中，所述的激活剂包括组蛋白去乙酰化酶抑制剂。

11、在另一优选例中，所述的组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括：tsa、scriptaid、或其组合。

12、在另一优选例中，所述激活剂中tsa浓度为0.1-50nm，优选地0.5-30nm，更优选地1-15nm，更优选地5-10nm。

13、在另一优选例中，所述的激活处理包括：使用tsa激活2-20小时，优选地6-14小时，更优选地8-10小时。

14、在另一优选例中，步骤(ii)中，进行重编程处理的核移植胚胎处于1细胞期、2细胞期、4细胞期、或8细胞期。

15、在另一优选例中，所述的重编程处理使用重编程处理剂进行。

16、在另一优选例中，所述的重编程处理剂包括：

17、(a)h3k9me3组蛋白去甲基化酶、编码其的mrna、编码其的的dna、或其组合；和/或

18、(b)h3k4me3组蛋白去甲基化酶、编码其的mrna、编码其的dna、或其组合。

19、在另一优选例中，所述的h3k9me3组蛋白去甲基化酶包括：kdm4d、kdm4b、或其组合。

20、在另一优选例中，所述的h3k4me3组蛋白去甲基化酶包括：kdm5b。

21、在另一优选例中，所述的重编程处理包括：将编码kdm4d蛋白的mrna和编码kdm5b的mrna注入所述的体细胞核移植胚胎的胚胎细胞中。

22、在另一优选例中，将102-108(较佳地104-106)拷贝/细胞的编码kdm4d蛋白的mrna注入所述核移植胚胎的细胞中。

23、在另一优选例中，将102-108(较佳地104-106)拷贝/细胞的编码kdm5b蛋白的mrna注入所述核移植胚胎的细胞中。

24、在另一优选例中，所述编码kdm4d的mrna处于一溶液中，所述mrna的浓度为50-4000ng/μl，更优选为80-3000ng/μl，更优选为100-1000ng/μl。

25、在另一优选例中，所述编码kdm5b的mrna处于一溶液中，所述mrna的浓度为50-4000ng/μl，更优选为80-3000ng/μl，更优选为100-1000ng/μl。

26、在另一优选例中，所述的步骤(ii)中，激活处理和重编程处理为先后进行、或在激活过程中进行重编程处理。

27、在另一优选例中，所述的步骤(ii)包括：对所述胚胎进行tsa激活处理2-10小时(优选地3-7小时，更优选地4-5小时)，随后进行重编程处理，随后再次tsa激活2-10小时(优选地3-7小时，更优选地4-5小时)。

28、在另一优选例中，步骤(iii)中所述的四倍体胚胎细胞来源于正常受精细胞。

29、在另一优选例中，所述的四倍体胚胎细胞由2-细胞阶段的正常受精胚胎细胞电融合得到。

30、在另一优选例中，所述用于聚合的四倍体胚胎细胞处于4-细胞时期。

31、在另一优选例中，所述的四倍体胚胎细胞的来源物种与所述体细胞克隆动物的物种相同。

32、在另一优选例中，所述的四倍体胚胎细胞后期发育为胎盘组织。

33、在另一优选例中，所述的内细胞团为去除了滋养层细胞的细胞团。

34、在另一优选例中，所述的聚合包括，将分离的内细胞团与两个四倍体胚胎聚合形成聚合胚胎。

35、在另一优选例中，所述分离的内细胞团与两个四倍体胚胎以四倍体胚胎-内细胞团-四倍体胚胎的结构聚合。

36、在另一优选例中，所述步骤(iv)包括：

37、(iv1)将所述经聚合胚胎在体外或体内培养至囊胚；和

38、(iv2)将所述囊胚移植到子宫中，从而获得所述体细胞克隆哺乳动物。

39、在另一优选例中，所述的移植为未侵入性移植(即不造成任何创伤)。

40、在另一优选例中，所述的子宫包括代孕动物的子宫、或人工子宫。

41、在另一优选例中，所述的代孕动物的物种与所述核移植卵的物种是相同的。

42、在另一优选例中，所述体细胞核移植卵用包括以下步骤的体外方法制备：

43、(a)提供一去核的非人哺乳动物的供质卵母细胞和供核的非人哺乳动物的体细胞；

44、(b)用显微注射法将用于供核的非人哺乳动物体细胞直接注射入所述的去核供质卵母细胞，从而获得所述体细胞核移植卵。

45、在另一优选例中，所述体细胞选自下组：成纤维体细胞、卵丘细胞、胚胎干细胞、精原细胞、睾丸支持细胞、间充质干细胞、皮肤细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、耳细胞、卵巢细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、神经细胞、成骨细胞、或其组合。

46、在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为小鼠、或非人灵长类动物(如猴)。

47、在另一优选例中，所述的方法是非治疗性和非诊断性的。

48、在本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，包括：

49、(a)重编程处理剂，其中所述的重编程处理剂包括：

50、(a1)h3k9me3组蛋白去甲基化酶、编码其的mrna、编码其的的dna、或其组合；和

51、(a2)h3k4me3组蛋白去甲基化酶、编码其的mrna、编码其的dna、或其组合；

52、(b)激活处理剂，所述激活处理剂包含组蛋白去乙酰化酶抑制剂；

53、(c)正常受精的哺乳动物四倍体胚胎细胞。

54、在另一优选例中，所述的试剂盒还包括一说明书，其中记载了如本发明第一方面所述的方法。

55、在本发明的第三方面，提供了一种如本发明第二方面所述的试剂组合的用途，用于制备一试剂盒，所述试剂盒用于制备体细胞克隆非人哺乳动物。

56、在另一优选例中，所述试剂盒中进一步含有标签或说明书，所述标签或说明书中记载了如本发明第一方面所述的方法。

57、在本发明的第四方面，提供了一种体细胞克隆非人哺乳动物，所述体细胞克隆非人哺乳动物使用如本发明第一方面所述的方法制备。

58、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。