一种调控棉花花发育的类钙调素蛋白编码基因Goano03G1369

一种调控棉花花发育的类钙调素蛋白编码基因goano03g1369
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种调控棉花花发育的类钙调素蛋白编码基因goano03g1369。


背景技术：

2.着丝粒(centromere)是真核生物染色体的重要构成部分，在细胞分裂过程中起着介导姐妹染色单体正常分离的作用，从而确保遗传物质的稳定传递。在物理结构上，植物着丝粒区域核小体的h3组蛋白通常会被特殊的组蛋白变体cenh3(centromeric histon 3)所替代，cenh3是植物动粒组装和染色体分离所必需的重要组成部分，是着丝粒的标志性特征，因此能与cenh3组蛋白变体特异结合的染色体区域被定义为功能着丝粒(functional centromere)。在序列组成上，着丝粒序列主要高度重复的dna序列构成，组装难度大，很难确定其序列。
3.由于着丝粒高度凝缩的异染色质状态和大量重复序列的存在，着丝粒一致被认为是转录惰性区，并没有功能基因的存在。然而目前的研究发现，部分植物如水稻(oryza sativa)，土豆(solanum tuberosum)，雷蒙德氏棉(g.raimondii)等物种的着丝粒区域中存在着少量基因，且这些基因对植物的生殖发育与抗逆等生物学过程发挥重要作用。如番木瓜(caricapapaya)的性别决定基因，水稻的广谱抗菌基因ebr1，暗示了着丝粒cenh3亚域活性基因可能在植物生长发育过程中发挥着重要作用，着丝粒中可能存在着编码特殊生物学功能的基因。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了解决着丝粒区难以定位，其中重要功能基因难以揭示的不足，而提出的通过chip-seq并结合转录组分析对异常棉着丝粒进行定位，深入挖掘出的一种调控棉花花发育的类钙调素蛋白编码基因goano03g1369。
5.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
6.一种调控棉花花发育的类钙调素蛋白编码基因goano03g1369。
7.优选地，所述基因goano03g1369为异常棉3号染色体功能着丝粒cenh3区域的goano03g1369基因。
8.优选地，所述基因goano03g1369 cds序列如seq id no.1所示。
9.优选地，所述基因goano03g1369为花器官特异表达。
10.优选地，所编码的蛋白具有cml蛋白家族特征ef手型结构域(ef-hand domain)。
11.其中，定位功能着丝粒及cenh3区域采用cenh3抗体的chip-seq方法进行。
12.所述基因的发现及功能分析，分别采用着丝粒区内搜索注释基因，并结合根、茎、叶及花等不同组织的转录组测序分析方法，搜索具有组织特异表达的基因获得。
13.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
14.1、本发明中的着丝粒是真核生物细胞分裂的重要功能区，且被证明含有重要生物
学功能基因。本发明从解决着丝粒定位难题，并发现了具有花发育特异表达基因，这是首次从棉花着丝粒中发现具有组织特异表达基因。
15.2、本发明中该基因注释分析显示，其属于类钙调素蛋白家族，该家族基因在生殖发育过程具有重要作用，结合组织表达特征，表明该基因在棉花花发育中具有重要作用，也是首个发现的在棉花生殖发育中发挥作用的类钙调素蛋白家族基因。
16.3、本发明采用独有开发的棉花着丝粒cenh3抗体，通过染色质免疫共沉淀结合的高通量测序技术(chip-seq)精确定义了着丝粒区以及其内部与cenh3结合区域。通过序列分析，发现位于cenh3结合区域的goano03g1369基因，转录组分析及基因注释分析显示其属于类钙调素蛋白编码基因且具有花发育的特异表达特征，证明该基因在异常棉等棉属中具有潜在的生殖发育调控作用，在棉属物种的雄性不育新材料创制及杂交种应用中具潜在价值。
附图说明
17.图1为本发明中异常棉3号染色体着丝粒chip-seq精细图及goano03g1369基因定位。图示为1kb窗口的chip-seq mapping的结果。测序reads峰为cenh3结合区。goano03g1369基因及其所在着丝粒定位显示其在3号染色体着丝粒内部的cenh3结合区。
18.图2为本发明中基因在根、茎、叶、花四个组织中的fpkm值示意图。
19.图3为本发明中goano03g1369基因在ncbi采用blastx比对获得的保守结构域预测注释信息。分析显示，该基因包含典型的ef手型结构域(ef-hand domain)。
具体实施方式
20.下面结合附图将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
21.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
22.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
23.实施例1：着丝粒特异组蛋白cenh3抗体的免疫沉淀(chip)分析
24.使用研钵和液氮研磨新鲜幼嫩的叶片，然后把研磨后的粉末转入到50ml的离心管中，加入m1缓冲液并经滤膜过滤；然后，经4℃1200g离心10min，轻轻倒出上清液，加入10ml的m 2缓冲液在样品中，4℃，1200g离心10min；加入5ml的mnb缓冲液，4℃，1200g离心10min，加入4ml的mnb缓冲液，重悬沉淀的核。
25.重悬核加入适量核酸酶，在37℃的水浴锅中孵育10min，加入15μl，0.5m的edta，终止反应；4℃，13000rpm离心10min。加入300μl的孵育缓冲液并且重悬细胞核并分装到两个新的离心管；分别加入4μl cenh3抗体(chip)和对照血清抗体到2个离心管中(input)，4℃孵育过夜。
26.孵育后的混合液加入1ml含有50mm氯化钠的buffera缓冲液；13000rpm离心30s，去除上清后加入1ml含有100mm氯化钠的buffera缓冲液，再经13000rpm离心30s，去除上清液；
加入400μl洗脱缓冲液65℃孵育15min，13000rpm离心1min，转移上清液到新的离心管中；加入400μl洗脱缓冲液65℃孵育15min；13000rpm离心1min，上清液移至离心管中。采用酚氯仿抽提并沉淀dna；干燥后，加如40-80μl的1
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te(ph 8.0)。
27.实施例2：着丝粒定位及cenh3结合区精确分析
28.首先，将实验获得的chip dna和input dna利用ultra
tm
dna标准文库制备试剂盒(new england biolabs inc.，ipswich，ma，usa)构建chip-seq与input-seq文库。然后，将构建好的文库进行库检，库检合格利用hiseq2500(illumina，san diego，ca，usa)测序平台进行上机测序。对于测序得到的chip reads和input reads，使用fastuniq软件去除pcr重复序列，然后使用trimmomatic软件去除数据中的接头以及低质量测序reads。质控后的数据再次进行质量评价，合格后即可得到后续分析所用的测序数据。
29.其次，采用sicer软件将通过质控的测序数据与基因组序列进行比对，保留只有一个单一比对位点的测序数据，并根据不同窗口大小进行测序数据的比对工作，获得不同窗口测序read的密度，以高丰度区间表示着丝粒区间；同时对其内部进行精细分析，获得高分辨率的chip-seq测序read丰度，定义着丝粒内部的cenh3结合区。
30.实施例3：着丝粒活性基因的搜索及基因注释
31.提取定义的着丝粒区序列，分别与the arabidopsis information resource(tair)、kegg、swiss-prot、go以及pfam等不同数据库进行比较，注释其中的功能基因，根据各个数据库统一注释结果界定基因及其潜在功能。同时，界定位于cenh3结合区的着丝粒基因。
32.实施例4：rna-seq生物信息学分析
33.首先，对测序数据进行质控和过滤。将过滤后的数据使用hisat2比对到参考基因组上。然后，利用stingtie软件，将比对结果的sam文件进行排序并转化为bam文件，根据基因的注释，可以获得每个基因的表达量。
34.据上述，将四个组织的rna-seq数据分别进行分析，并比较着丝粒区基因的组织间表达情况，根据组织表达差异情况可以获得具有花组织特异表达且位于着丝粒区的goano03g1369基因，结合上述基因注释结果，可知其属于类钙调素蛋白编码基因家族，该家族基因在生殖发育过程具有重要调控作用。因此，根据着丝粒的重要作用可以推断该基因是具备不可或缺重要生物学功能，加之其花组织的特异表达，可以推断其在棉花生殖发育调控中发挥作用，在棉属物种的雄性不育新材料创制及杂交种应用中具潜在价值。
35.本发明中披露的说明和实践，对于本技术领域的普通技术人员来说，都是易于思考和理解的，且在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，也应视为本发明的保护范围。