用于检测大丽轮枝菌的引物组合、试剂盒及应用

本发明涉及生物检测，尤其涉及一种用于检测大丽轮枝菌的引物组合、试剂盒及应用。

背景技术：

1、黄栌(cotinus coggygria)为漆树科(anacardiaceae)黄栌属(cotinus)植物，落叶灌木或小乔木，秋季叶色变红，极具观赏价值和经济价值，是北京香山公园秋季红叶景观的主要树种。自上世纪80年代香山发现黄栌枯萎病以来，其发生有逐年加重的趋势。该病害导致黄栌叶片萎蔫，同时自叶缘向内发黄，或失水卷曲，但通常不脱落；根、茎的维管束出现坏死，木质部与皮层交界处出现褐色带线，部分树杈迅速死亡，发病严重时可导致整株长势衰弱或死亡。

2、黄栌枯萎病的病原菌为大丽轮枝菌(verticillium dahliae)，其无性世代属于半知菌亚门(deuteromycotina)丝孢纲(hyphomycetes)轮枝孢属(verticillium)，菌落表面常形成黑色微菌核，其温度适应范围较宽，具有耐高温特性。大丽轮枝菌为典型土壤习居菌，土壤中的微菌核萌发产生的菌丝通过黄栌根系表面的伤口侵入维管束，然后产生分生孢子沿维管束随蒸腾流向上扩展。大丽轮枝菌在寄主体内扩展缓慢、潜伏期长，当叶片出现明显萎蔫症状时，其根部及茎干内已经存在大量病原菌，使其易错过最佳防治期，造成病害大面积暴发。

3、针对黄栌枯萎病的检测方法主要包括病原物分离、鉴定。但传统的病原物分离、鉴定方法费时费力，在检测时间和操作水平上都存在较大的不足，难以对大量苗木进行快速检测。因此，建立快速、高灵敏度的黄栌枯萎病菌检测技术对黄栌枯萎病的防治具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于检测大丽轮枝菌的引物组合、试剂盒及应用。本发明提供的引物组合能快速检测目标基因，灵敏度高，特异性强，对大丽轮枝菌感染导致的黄栌枯萎病防治具有重要意义。

2、本发明提供了一种用于检测大丽轮枝菌的引物组合，所述引物组合包括rpa引物对和crrna；所述rpa引物对的靶标基因包括大丽轮枝菌its基因；所述crrna的靶标基因包括大丽轮枝菌its基因。

3、优选地，所述rpa引物对包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列包括seq_1、seq_2、seq_3和seq_4中的一种；所述下游引物的序列包括seq_5、seq_6、seq_7和seq_8中的一种。

4、优选地，所述上游引物的序列包括seq_1；所述下游引物的序列包括seq_6。

5、优选地，所述crrna包括框架核酸片段序列和向导序列；所述向导序列包括seq_14、seq_15和seq_16中的一种。

6、优选地，所述框架核酸片段序列包括seq_13；所述向导序列包括seq_15。

7、优选地，所述rpa引物对包括seq_1和seq_6；所述crrna包括框架核酸片段序列seq_13和向导序列seq_15。

8、本发明提供了一种用于检测大丽轮枝菌的试剂盒，包括所述引物组合，还包括depc水、lwacas13a缓冲液、lwacas13a蛋白、ntp buffer mix、t7 rna polymerase mix、rnase inhibitor、rna reporter和大丽轮枝菌质粒标准品。

9、本发明还提供了所述引物组合或者所述试剂盒在检测大丽轮枝菌中的应用。

10、优选的，所述应用包括如下步骤：

11、s1、提取待测样本基因组dna，以所述待测样本基因组dna为模板，进行rpa扩增，得到rpa产物；

12、s2、以所述rpa产物为模板，构建大丽轮枝菌crispr/cas13检测体系。

13、优选的，步骤s2所述crispr/cas13检测体系为：depc水8.4μl、lwacas13a缓冲液2μl、lwacas13a蛋白1μl、crrna 2μl、ntp buffer mix 1μl、t7 rna polymerase mix 0.6μl、rnase inhibitor 0.5μl、rna reporter 2.5μl和大丽轮枝菌rpa产物2μl。

14、有益效果：

15、本发明提供了一种用于检测大丽轮枝菌的引物组合、试剂盒及应用。所述引物组合、试剂盒包括rpa引物对和crrna；其中，rpa引物对和crrna均能特异性地检测大丽轮枝菌中的tis基因。本发明提供的引物组合、试剂盒将rpa扩增技术和crispr检测技术结合起来，实现了对大丽轮枝菌的快速检测，具有灵敏度高，特异性强，检测效率高的优点。将本发明所述引物组合、试剂盒应用于大丽轮枝菌的检测，对大丽轮枝菌感染导致的黄栌枯萎病的防治具有重要意义。

技术特征：

1.用于检测大丽轮枝菌的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括rpa引物对和crrna；所述rpa引物对的靶标基因包括大丽轮枝菌its基因；所述crrna的靶标基因包括大丽轮枝菌its基因。

2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述rpa引物对包括上游引物和下游引物；所述上游引物的序列包括seq_1、seq_2、seq_3和seq_4中的一种；所述下游引物的序列包括seq_5、seq_6、seq_7和seq_8中的一种。

3.根据权利要求2所述的引物组合，其特征在于，所述上游引物的序列包括seq_1；所述下游引物的序列包括seq_6。

4.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述crrna包括框架核酸片段序列和向导序列；所述向导序列包括seq_14、seq_15和seq_16中的一种。

5.根据权利要求4所述的引物组合，其特征在于，所述框架核酸片段序列包括seq_13；所述向导序列包括seq_15。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的引物组合，其特征在于，所述rpa引物对包括seq_1和seq_6；所述crrna包括框架核酸片段序列seq_13和向导序列seq_15。

7.用于检测大丽轮枝菌的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-6任意一项所述引物组合，还包括depc水、lwacas13a缓冲液、lwacas13a蛋白、ntp buffer mix、t7 rnapolymerase mix、rnase inhibitor、rna reporter和大丽轮枝菌质粒标准品。

8.权利要求1-6任意一项所述引物组合或者权利要求7所述试剂盒在检测大丽轮枝菌中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤s2所述crispr/cas13检测体系为：depc水8.4μl、lwacas13a缓冲液2μl、lwacas13a蛋白1μl、crrna 2μl、ntp buffer mix 1μl、t7 rna polymerase mix 0.6μl、rnase inhibitor 0.5μl、rna reporter 2.5μl和大丽轮枝菌rpa产物2μl。

技术总结
本发明涉及一种用于检测大丽轮枝菌的引物组合、试剂盒及应用。所述引物组合包括RPA引物对和crRNA；所述RPA引物对的靶标基因包括大丽轮枝菌ITS基因；所述crRNA的靶标基因包括大丽轮枝菌ITS基因。本发明提供的引物组合、试剂盒将RPA扩增技术和CRISPR检测技术结合起来，实现了对大丽轮枝菌的快速检测，具有灵敏度高，特异性强，检测效率高的优点。将本发明所述引物组合、试剂盒应用于大丽轮枝菌的检测，对因大丽轮枝菌感染导致的黄栌枯萎病的防治具有重要意义。

技术研发人员：王永林,陈琦,唐晨,黄建东
受保护的技术使用者：北京林业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12