一种靶向CA9的融合嵌合抗原受体、重组表达载体及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程，具体涉及一种靶向ca9的融合嵌合抗原受体、重组表达载体及其应用。

背景技术：

1、细胞免疫治疗是一种正在兴起的肿瘤治疗方法，其通过分子生物学技术构建嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)的表达载体，并将该表达载体导入到从人体分离的免疫细胞中，使其细胞表面表达car后，将其回输至人体。表达car的免疫细胞能够特异性识别靶细胞，并对其进行杀伤。然而，car t细胞在治疗实体瘤的过程中却屡屡碰壁，现在仍然面临诸多问题及挑战，新型的car结构，新的靶点的发掘是car-t治疗实体瘤的关键。

2、ca9(carbonic anhydrase 9)是一种跨膜蛋白，是已知仅有的两种与肿瘤相关的碳酸酐酶同工酶之一。在以往的研究中发现，除了在正常组织中表达外，ca9在肺鳞癌，肺腺癌，膀胱尿路上皮癌，乳腺浸润癌，宫颈鳞癌和腺癌，胆管癌，多形成性胶质细胞瘤，头颈癌，肾透明细胞癌，肾乳头状细胞癌，胰腺癌，直肠癌，肉瘤，胸腺癌，胃癌，子宫内膜样癌等多种癌症中，ca9表达升高。在众多的肿瘤免疫相关分子中，ca9可以作为实体瘤免疫治疗的一个理想靶标，因此，在治疗上述肿瘤疾病时，最好能够使用可靶向ca9的药物或疫苗。

3、il-15sa融合蛋白可以延长il15在血清中的半衰期并增加il15β受体对免疫细胞的亲和力，募集cd8+t细胞、cd4+t细胞、自然杀伤细胞和肥大细胞，能够特异性结合il-15并与周围效应nk细胞和t细胞上的il-15r β-γ链形成免疫突触结构，激活nk/t细胞的jak/stat等通路发挥作用(cheever ma，et al.2008；mortier e，et al.2006)。促进cd3+t细胞(主要是cd8+t细胞)和nk1.1+nk细胞增殖；增强体内细胞因子对igg或t细胞参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的影响(waldmann ta，et al.2020；akdis m，et al.2011)；il-15还可以促进寿命更长、亲和力更高的cd8+t细胞的诱导，可以非常有效地杀死肿瘤细胞，最终增强免疫疗法的抗肿瘤作用(xu h，et al.2021；qiyue hu，et al.2018；martin a，etal.2008)。

4、il1rl2/il-36r受体结合并通过其发出信号的细胞因子，进而激活靶细胞中的nf-kappa-b和mapk信号通路。il-36信号系统的一部分，被认为存在于上皮屏障中并参与局部炎症反应；类似于与其共享辅助受体il1rap的il-1系统。通过作用于角质形成细胞、树突状细胞和间接作用于t细胞来驱动组织浸润、细胞成熟和细胞增殖，从而参与皮肤炎症反应(bachmann m，et al.2012)。在培养的角质形成细胞中诱导巨噬细胞、t细胞和中性粒细胞趋化因子的表达，例如ccl3、ccl4、ccl5、ccl2、ccl17、ccl22、cl20、ccl5、ccl2、ccl17、ccl22、cxcl8、ccl20和cxcl1；还刺激其自身的表达以及原型皮肤促炎参数tnf-α、s100a7/牛皮癣和诱导型nos的表达(gresnigt m.s，et al.2013)。可能在特定中性粒细胞气道炎症期间的促炎反应中发挥作用：激活原发性肺成纤维细胞中的丝裂原活化蛋白激酶和nf-kappa b，并刺激肺成纤维细胞中il-8和cxcl3和th17趋化因子ccl20的表达。可能参与对真菌病原体(如烟曲霉)的先天免疫反应(debets r，et al.2001；foster a.m，et al.2014)。将il-36-γ基因工程入car，可以显著的改善增殖和持久性。表达il-36γ的car-t细胞能够增强肿瘤小鼠脾巨噬细胞和树突状细胞上mhc ii类和cd86的表达，提示il-36在抗原提呈细胞的成熟中发挥作用。在小鼠模型，显示出超强的抗肿瘤活性(li x，etal.2020)。

5、cxcl11(c-x-c motif chemokine ligand 11，c-x-c基序趋化因子11又名干扰素诱导的t细胞α趋化因子(i-tac))，是cxc趋化因子家族中的小分子量细胞因子(huoman j，et al.2021)。它在外周血白细胞、胰腺和肝脏中高度表达，在胸腺、脾和肺中中等程度表达，在小肠、胎盘和前列腺组织中低度表达(moreno b，et al.2022)。cxcl11通过与细胞表面趋化因子受体cxcr3相互作用来作用于靶细胞。cxcl11可以趋化活化的t细胞(rot a，etal.2010；lil，et al.2022)。

6、ccr8(c-c motif chemokine receptor 8)是趋化因子受体亚家族的成员之一，属于g蛋白偶联受体。人ccl1是ccr8的主要配体，其它配体有ccl8、ccl16和ccl18。ccr8在肿瘤浸润的调节性t细胞(treg)上特异性表达，在th2细胞和肿瘤细胞也均有表达；然而在外周血treg或正常组织上基本不表达。ccr8的主要作用是参与tregs和th2细胞向炎症和肿瘤部位的募集。大量研究发现，高表达的ccr8与多种癌症相关，包括结直肠癌、乳腺癌、胃癌、转移性脑癌、转移性肝癌，尤其是在乳腺癌分离的tregs细胞上(karin，，et al.2018；das，suvendu，et al..2013)。

7、ccli结合cd4+t细胞上的ccr8，导致cd4+t细胞转化为tregs，再募集tregs；ccl1结合tregs上的ccr8，tregs向炎症或肿瘤部位募集。ccr8-ccl1轴不仅将ccr8+tregs招募到tme中。ccr8-ccl1还可诱导对tregs抑制至关重要的fo×p3和cd39，以及il-10的上调，这将增强treg的免疫抑制活性。研究发现，与正常组织中的tregs相比，ccr8在人类乳腺癌的肿瘤浸润性tregs中显著上调，表明ccr8是tme中tregs上的一个有希望的治疗靶点，而不会引起系统性自身免疫(whiteside，sarah k.，et al.2021；roose，heleen，et al.2021；korbecki，jan，et al.2020)。

8、cxcr6(c-x-c motif chemokine receptor 6)，编码的蛋白质及其独有的配体趋化因子配体16(ccl16)是调节t淋巴细胞迁移到各种外周组织(肝、脾红髓、肠、肺和皮肤)并促进细胞-细胞迁移的信号通路的一部分。与树突状细胞和成纤维细胞网状细胞相互作用。cxcr6/ccl16还控制常驻记忆t淋巴细胞在肺不同区域的定位，并维持气道常驻记忆t淋巴细胞(angelo ls，et al.2022；dai y，et al.2021)。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提出一种靶向ca9的融合嵌合抗原受体、重组表达载体及其应用。

2、本发明涉及一种融合蛋白，其包含靶向ca9的嵌合抗原受体(car)和增效结构域，具有提高car-t细胞的浸润能力和招募免疫细胞的能力的效果。

3、本发明涉及一种靶向表达ca9表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体，可分泌il-15sa融合蛋白、cxcl11或il-36γ，募集其他免疫细胞，例如，t细胞，nk细胞，树突状细胞，巨噬细胞，单核细胞等。

4、本发明涉及一种靶向表达ca9表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体，表达ccr8或cxcr6，可以增强car-t细胞浸润癌组织。

5、本发明涉及一种靶向表达ca9表面抗原细胞的融合嵌合抗原受体，可分泌il-15sa融合蛋白、il-36γ或cxcl11，表达ccr8或cxcr6。募集其他免疫细胞，例如，t细胞，nk细胞，树突状细胞，巨噬细胞，单核细胞等，并促进car-t细胞浸润癌组织。

6、本发明的技术方案是这样实现的：

7、如图1-4，本发明提供一种靶向表达ca9表面抗原细胞且分泌il-15sa融合蛋白或il-36γ，cxcl11并在膜上表达ccr8或cxcr6的融合嵌合抗原受体，包含cd8α信号肽、靶向ca9的scfv、strep ii标签蛋白，cd8α铰链域，cd28跨膜结构域和cd28细胞内信号结构域，41-bb共刺激域，cd3ζ信号传导域，分泌il-15sa、il-36γ或cxcl11融合蛋白的结构域，膜表达ccr8或cxcr6的结构域。

8、作为本发明的进一步改进，所述靶向ca9的scfv的氨基酸序列包括如seq id no：1至seq id no：24；其对应的核苷酸序列包括seq id no：25至seq id no：48。

9、作为本发明的进一步改进，所述cd8α信号肽的氨基酸序列如seq id no：49所示，strep ii标签蛋白的氨基酸序列如seq id no：51所示，cd8α铰链域的氨基酸序列如seq idno：53所示，cd28跨膜域的氨基酸序列如seq id no：55所示，cd28细胞内信号结构域的氨基酸序列如seq id no：57所示，4-1bb共刺激域的氨基酸序列如seq id no：59所示，cd3ζ信号传导域的氨基酸序列如seq id no：61所示。

10、作为本发明的进一步改进，所述cd8α信号肽的核苷酸序列如seq id no：50所示，strep ii标签蛋白的核苷酸序列如seq id no：52所示，cd8α铰链域的核苷酸序列如seq idno：54所示，cd28跨膜域的核苷酸序列如seq id no：56所示，cd28细胞内信号结构域的核苷酸序列如seq id no：58所示，4-1bb共刺激域的核苷酸序列如seq id no：60所示，cd3ζ信号传导域的核苷酸序列如seq id no：62所示。

11、作为本发明的进一步改进，所述分泌il-15sa融合蛋白结构域的氨基酸序列如seqid no：63所示，分泌il-36γ融合蛋白结构域的氨基酸序列如seq id no：65所示，分泌cxcl11融合蛋白结构域的氨基酸序列如seq id no：67所示。

12、作为本发明的进一步改进，所述分泌il-15sa融合蛋白结构域的核苷酸序列如seqid no：64所示，分泌il-36γ融合蛋白结构域的核苷酸序列如seq id no：66所示，分泌cxcl11融合蛋白结构域的核苷酸序列如seq id no：68所示。

13、作为本发明的进一步改进，所述膜表达ccr8结构域的氨基酸序列如seq id no：69所示，膜表达cxcr6结构域的氨基酸序列如seq id no：71所示。

14、作为本发明的进一步改进，所述膜表达ccr8结构域的核苷酸序列如seq id no：70所示，膜表达cxcr6结构域的核苷酸序列如seq id no：72所示。

15、优选的，所述剪切信号肽为t2a和p2a，其氨基酸序列分别为seq id no：73，和seqid no：75，核苷酸序列分别为seq id no：74，和seq id no：76。

16、优选的，所述ca9 scfv轻链与重链之间的连接子为(g4s)3linker，其氨基酸序列为seq id no：77所示，核苷酸序列为seq id no：78。

17、ca9 scfv轻链与重链的氨基酸序列如表1。

18、表1

19、

20、

21、

22、

23、本发明进一步保护一种表达上述的融合嵌合抗原受体的重组表达载体，包括融合嵌合抗原受体表达框，所述融合嵌合抗原受体表达框由可在t细胞中表达的启动子和位于所述启动子下游的编码所述融合嵌合抗原受体的核酸组成。

24、作为本发明的进一步改进，所述启动子为rsv启动子，cmv启动子，sv40启动子、ef-1α启动子。

25、作为本发明的进一步改进，所述重组表达载体通过将所述编码融合嵌合抗原受体的核酸插入慢病毒表达载体中的ef-1α启动子的3’下游得到。

26、另一方面，本技术提供了一种增强靶向ca9的嵌合抗原受体对肿瘤细胞的杀伤能力的方法，其中所述方法包括以下步骤：使用所述靶向ca9的嵌合抗原受体与增效结构域连接，其中所述增效结构域包含选自下组的蛋白质或功能片段：il-15sa、il-36γ、cxcl11、ccr8和cxcr6。

27、在某些实施例中，所述靶向ca9的嵌合抗原受体的c端与所述增效结构域的n端直接或间接的相连。

28、本发明还提供了一种表达上述融合嵌合抗原受体的重组表达载体，其包括嵌合抗原受体表达框和复制系统，所述嵌合抗原受体表达框由可在t细胞中表达的启动子和位于所述启动子下游的编码所述嵌合抗原受体的核酸组成。

29、本发明进一步保护如上述的融合嵌合抗原受体或如上述的重组表达载体在制备治疗肿瘤的产品中的应用。

30、作为本发明的进一步改进，所述肿瘤包括肺鳞癌，肺腺癌，膀胱尿路上皮癌，乳腺浸润癌，宫颈鳞癌和腺癌，胆管癌，多形成性胶质细胞瘤，头颈癌，肾透明细胞癌，肾乳头状细胞癌，胰腺癌，直肠癌，肉瘤，胸腺癌，胃癌，子宫内膜样癌。提供更高效并且副作用和不良反应更少的方法。

31、在本发明中，所述结合靶点、单链抗体氨基酸序列、单链抗体核苷酸序列、载体、细胞名称的对应关系如下表2：

32、表2

33、

34、

35、本发明具有如下有益效果：

36、本发明在t细胞表面表达ccr8或cxcr6可增加免疫细胞浸润，进而增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。在这种治疗方法中，car、il-15sa融合蛋白、il-36γ、cxcl11与趋化因子ccr8，cxcr6的作用至关重要。融合嵌合抗原受体包括单链抗体结构域、跨膜结构域、胞内信号结构域，il-15sa融合蛋白，il-36γ、cxcl11分泌结构域，趋化因子ccr8、cxcr6结构域。其中，单链抗体结构域将免疫细胞靶向目标细胞，胞内信号结构域释放胞内信号，启动免疫细胞的杀伤活性，il-15sa融合蛋白、il-36γ、cxcl11招募其他免疫细胞，ccr8，cxcr6促进car-t细胞的肿瘤浸润。

37、通过将本发明的融合嵌合抗原受体表达于t细胞中，可使得到car-t细胞能够有效并且特异性地靶向表达ca9表面抗原的恶性细胞，分泌il-15sa融合蛋白或cxcl11，il-36γ和膜表达ccr8或cxcr6。可以更好的使t细胞激活，增强免疫细胞浸润，同时募集更多的免疫细胞，例如，nk细胞，树突状细胞，巨噬细胞，粒细胞。从而为治疗一些表达ca9表面抗原的实体肿瘤，例如肺鳞癌，肺腺癌，膀胱尿路上皮癌，乳腺浸润癌，宫颈鳞癌和腺癌，胆管癌，多形成性胶质细胞瘤，头颈癌，肾透明细胞癌，肾乳头状细胞癌，胰腺癌，直肠癌，肉瘤，胸腺癌，胃癌，子宫内膜样癌等，提供更高效并且副作用和不良反应更少的方法。