一种腺相关病毒变体及其应用

本发明涉及生物，具体涉及一种腺相关病毒变体及其应用。

背景技术：

1、腺相关病毒(adeno-associated viruses，aav)是一类小型、无包膜的病毒，病毒内部包装的基因组为一条长度约4.70kb的线状单链dna基因组(ssdna)。aav直径为25nm，拥有二十面体稳定结构的衣壳，衣壳主要负责结合宿主细胞受体，单链dna包含两个功能基因。aav衣壳由三种衣壳蛋白vp1、vp2和vp3组成，三种蛋白的比例为1:1:10，共60个衣壳蛋白组成一个完整的aav衣壳，vp1和vp2蛋白共享vp3序列。

2、作为一种基因导入系统，aav病毒载体具有安全性好，免疫原性低，能感染分裂细胞和非分裂细胞，能介导基因的长期稳定表达等优点。腺相关病毒的衣壳识别细胞受体，直接跟宿主接触，很大程度上决定了aav的侵染效率和靶向性。提高aav侵染效率从而降低治疗成本仍然是目前亟需解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种腺相关病毒变体及其应用。

2、第一方面，本发明要求保护一种腺相关病毒衣壳蛋白变体。

3、本发明要求保护的腺相关病毒衣壳蛋白变体含有seq id no.1所示多肽。

4、本发明aav衣壳蛋白质变体可以通过将所述多肽插入至任何aav(诸如aav类型1(aav1)、aav类型2(aav2)、aav类型3(aav3)、aav类型4(aav4)、aav类型5(aav5)、aav类型6(aav6)、aav类型7(aav7)、aav类型8(aav8)、aav类型9(aav9)、aav类型10(aav10)、aav类型11(aav11)、禽aav、牛aav、犬aav、马aav或羊aav)的aav衣壳蛋白质，或使用所述多肽替换部分aav衣壳蛋白质氨基酸序列(换而言之，通过产生包含所述多肽的aav衣壳蛋白质)制备。并且可以进一步包括插入、添加、替换或缺失一个至数个氨基酸或多于一个氨基酸。

5、进一步地，所述腺相关病毒为9型腺相关病毒或dj型腺相关病毒。

6、进一步地，所述腺相关病毒衣壳蛋白变体为向所述腺相关病毒衣壳蛋白的氨基酸序列中插入seq id no.1所示多肽后得到。

7、更进一步地，所述插入为将seq id no.1所示多肽插入所述腺相关病毒的衣壳蛋白vp1、vp2和vp3三者中的全部或任意两种或任意一种。

8、更加具体地，所述插入可为将seq id no.1所示多肽插入所述腺相关病毒的衣壳蛋白vp1、vp2和vp3三者的共享区域。

9、所述插入可为将seq id no.1所示多肽插入所述腺相关病毒的衣壳蛋白vp1的如下三个位置中的任一个：第450-460位氨基酸之间；第585-590位氨基酸之间；第668和669位氨基酸之间；即vp2的313-323位、443-453位、531-532氨基酸之间；vp3的248-258位、378-388位、466-467位氨基酸之间。

10、在本发明的一些案例中，所述插入为将seq id no.1所示多肽插入9型腺相关病毒的衣壳蛋白vp1(氨基酸序列如seq id no.5所示)的第588和589位氨基酸之间，对应9型腺相关病毒的衣壳蛋白vp2(氨基酸序列如seq id no.6所示)的第451和452位氨基酸之间，同时对应9型腺相关病毒的衣壳蛋白vp3(氨基酸序列如seq id no.7所示)的第386和387位氨基酸之间。基于此，本领域技术人员可以容易地鉴定aav9之外的aav血清型和分化体的衣壳蛋白质的氨基酸对应于在aav9 vp1氨基酸编号588的氨基酸。例如，aav9 vp1的氨基酸编号588对应aav1的氨基酸编号588、aav2的氨基酸编号587和aav8的氨基酸编号590。

11、在本发明的一些案例中，所述插入为将seq id no.1所示多肽插入dj型腺相关病毒的衣壳蛋白vp1(seq id no.10)的第588和589位氨基酸之间。

12、即，对于被制成含有所述肽的aav衣壳蛋白质，可以使用aav vp1、vp2和vp3。可以仅vp1、vp2和vp3中任意一种被制成含有所述多肽，或可以vp1、vp2和vp3的全部被制成含有所述多肽。此外，两种衣壳蛋白质，诸如vp1和vp2、vp2和vp3或vp1和vp3可以被制成含有所述多肽。通过aav基因组中的cap基因区域编码vp1至vp3。在本发明的一个实施方案中，由vp1至vp3共享的区域被制成含有所述肽，因此可以将突变导入至全部vp1至vp3中。在本发明的另一个实施方案中，编码vp1、vp2或vp3的基因从aav的cap基因分别制备，并且将突变导入至所述基因。

13、此外，可以向所述多肽的n端和/或c端添加间隔序列(spacer sequence)后插入或替换入aav衣壳蛋白。间隔序列优选地由1至5个氨基酸残基组成。组成间隔序列的氨基酸残基是特别限制的。例如，间隔序列可以包括选自丙氨酸和丝氨酸的氨基酸。

14、第二方面，本发明要求保护一种核酸分子。

15、本发明要求保护的核酸分子为编码前文第一方面中所述腺相关病毒衣壳蛋白变体的核酸分子。

16、在本发明的具体实施方式中，在所述腺相关病毒衣壳蛋白变体中，编码vp1蛋白的核酸分子如seq id no.4所示，编码vp2蛋白的核酸分子如seq id no.4的第412-2235位所示，编码vp3蛋白的核酸分子如seq id no.4的第607-2235位所示。

17、其中，seq id no.4为在aav9的cap基因(seq id no.3)的第1764和1765位碱基之间插入seq id no.2所示dna片段后得到的。seq id no.2为seq id no.1所示多肽的编码基因。

18、本发明的核酸可以操作地连接至合适的启动子序列、聚腺甘酸化信号、转录终止序列、上游调节域、复制起始位点、内部核糖体进入位点(ires)和/或增强子。启动子序列的实例包括诱导型启动子序列和组成型启动子序列。所述启动子序列、聚腺甘酸化信号、转录终止序列、上游调节域、复制起始位点、内部核糖体进入位点(ires)和/或增强子可以是衣壳蛋白质来源的aav的内源性或外源性序列、天然序列或合成的序列。

19、本发明的核酸分子可用于在体外、先体外后体内或在体内递送至细胞，并且赋予细胞表达aav衣壳蛋白质变体的能力。随后，被递送本发明核酸的细胞可用于生产aav颗粒。所述细胞可为动物细胞(优选哺乳动物细胞)中。

20、第三方面，本发明要求保护含有前文第二方面中所述核酸分子的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。

21、在本发明中，所述载体可为质粒dna、噬菌体dna、转座子、粘粒dna、附加体dna或病毒载体。

22、本发明还提供了转基因细胞系，涉及宿主细胞，例如分离的宿主细胞，其含有本发明的核酸分子。分离的细胞是，例如，在体外维持的细胞系。如下文解释的，本发明的宿主细胞可用于本发明的aav颗粒的生产。当本发明的宿主细胞被用于aav颗粒的生产时，宿主细胞可以称为“包装细胞”或“生产者细胞(producer cell)”。本发明的宿主细胞可以包括在细胞中保留所述核酸分子或所述表达载体从而瞬时表达aav衣壳蛋白质变体。

23、本发明的所述核酸分子或所述表达载体至宿主细胞的导入可以通过已知方法执行。例如，可以使用电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射至细胞中、脂质体介导的基因转染或使用高速颗粒基因枪的核酸递送。当使用病毒载体时，可以选择适合用于载体的感染方法。通过使用这样的已建立的技术，本发明的所述核酸分子或所述表达载体被稳定地导入至宿主细胞的染色体中或暂时进入宿主细胞的细胞质中。为了稳定的转染，可以将选择性标记，例如，熟知的选择性标记诸如新霉素抗性基因(编码新霉素磷酸转移酶)或潮霉素b抗性基因(编码氨基糖昔磷酸转移酶(aph))连接至本发明的所述核酸分子或所述表达载体。

24、作为宿主细胞，可以使用多种细胞，例如，哺乳动物细胞，包括小鼠细胞和灵长类动物细胞(例如，人细胞)或昆虫细胞。合适的哺乳动物细胞的实例包括，但不限于灵长类动物和细胞系。合适的细胞系的实例包括hek293t细胞、a375细胞、rko细胞、hela细胞、sw620细胞、k562细胞、huh7细胞、a549细胞和衍生自它们的细胞。

25、第四方面，本发明要求保护一种腺相关病毒变体。

26、本发明要求保护的腺相关病毒变体(或aav颗粒)，含有前文第一方面中所述腺相关病毒衣壳蛋白变体。

27、本发明的aav颗粒是包含具有seq id no.1的氨基酸序列的多肽的aav衣壳蛋白质变体的aav颗粒。aav颗粒可以从上文的转基因细胞系中生产。本发明的aav颗粒具有对癌细胞、人各组织ptc、人各组织包括脑、乳腺等器官的噬性，并且可以将基因导入上述细胞或组织中。通过本发明的aav颗粒导入的基因在上文提及的组织、器官和细胞中强烈表达。

28、为了aav颗粒的生产，可以将包括aav颗粒生产所需的一些元件的细胞用作包装细胞。第一元件是用于重组aav的载体基因组，其可以在宿主细胞中复制并且包装在aav颗粒中。重组aav载体基因组包括目标异源多核苷酸和位于目标异源多核苷酸每一侧的5'和3'末端反向重复(itr)序列。itr序列的核苷酸序列是已知的。例如，aav2 itr序列。作为aavitr序列，可以使用来源于任意多种aav血清型的itr序列，所述aav血清型包括aav 1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav7、aav9等。在本发明中使用的itr序列可以来源于野生型aav或可以通过插入、缺失或替换一个或多个核苷酸而被修改。itr序列能够在rep蛋白质存在下复制重组aav载体基因组，并且使得能够在aav颗粒的形成中将重组aav载体基因组并入衣壳颗粒。

29、可以在本发明的aav颗粒中含有的目标异源多核苷酸的大小通常小于约5千个碱基(kb)。目标异源多核苷酸可以是，例如，编码受体缺少或丢失的目标蛋白质的基因、编码具有特定生物学或治疗活性(例如，抗微生物、抗病毒或抗肿瘤活性)的蛋白质的基因、编码抑制有害蛋白质产生的核苷酸序列或编码抗原蛋白质的核苷酸序列。可以根据目的合适地选择目标异源多核苷酸。

30、生产aav颗粒所需的第二元件是提供aav辅助功能的构建体。编码aav来源基因的构建体提供了aav颗粒形成所需要的aav基因产物。为了本发明的aav颗粒的生产，至少将编码包含具有seq id no.1的氨基酸序列的多肽的aav衣壳蛋白质变体的核酸作为cap基因使用。可以将上文所述的转基因细胞系用于aav颗粒的生产。aav颗粒具有由很多衣壳蛋白质构成的壳。全部衣壳蛋白质可以是变体，或部分衣壳蛋白质可以是变体并且其它的可以是野生型衣壳蛋白质。本发明的aav颗粒可以包括一种衣壳蛋白质变体或数种衣壳蛋白质变体。

31、生产aav颗粒所需的第三元件是用于aav复制的辅助病毒功能(也称为附属功能)。为导入辅助功能，通常使用腺病毒。然而，还可以使用其它病毒诸如单纯疱疹病毒(herpessimplex virus)类型t或类型-2和牛痘病毒。当使用病毒时，使用作为辅助病毒的病毒感染宿主细胞。例如，因为包装aav颗粒只需要腺病毒早期基因的表达，可以使用不展示晚期基因表达的腺病毒。还可以使用缺少晚期基因表达(例如，tslook或tsl49腺病毒变体)的腺病毒变体。还可以通过使用从辅助病毒分离的辅助病毒功能所需的核酸制备提供辅助病毒功能的核酸构建体，并且随后可以将其导入至宿主细胞中。提供辅助病毒功能的结构包括提供一种或多种辅助病毒功能的核苷酸序列，并且是以质粒、噬菌体、转座子、粘粒或其它病毒的形式提供至宿主细胞。

32、为了生产aav颗粒，执行(a)将第一元件，重组aav载体基因组导入至宿主细胞的步骤，(b)将第二元件，提供aav辅助功能的构建体导入至宿主细胞的步骤，和(c)将第三元件，辅助病毒功能导入至宿主细胞的步骤。步骤(a)至(c)的顺序可以是任何顺序。当第一至第三元件被导入至宿主细胞时，rep基因表达产物切除并且复制重组载体基因组。表达的衣壳蛋白质形成衣壳，并且将重组载体基因组包装至衣壳中以生产aav颗粒。当宿主细胞表达aav衣壳蛋白质变体时，生产的aav颗粒的壳包括aav衣壳蛋白质变体。

33、aav颗粒可以从宿主细胞的培养上清液或裂解产物通过多种提纯方法(诸如cacl密度梯度离心)分离和纯化。例如，当病毒在上文描述的步骤(c)中使用时，可以添加将aav颗粒(基于它们的大小)从辅助病毒分离的步骤。aav颗粒还可以基于对肝素的亲和性的差异从辅助病毒分离。此外，可以通过已知方法使剩余的辅助病毒失活。例如，约60℃加热20分钟或以上使腺病毒失活。因为aav颗粒对热非常稳定，上文描述的处理对作为辅助病毒使用的腺病毒的选择性移除是有效的。

34、第五方面，本发明要求保护前文第一方面中所述腺相关病毒变体在作为基因导入载体中的应用。如应用于眼、脑、肌肉、心脏、肝脏的遗传性疾病，如杜氏肌营养不良症dmd，脊髓性肌萎缩症smn等。

35、通过上文获得的本发明的aav颗粒被用于为了基因治疗目的或其它目的将目标异源多核苷酸递送至细胞。aav颗粒通常在体内或在体外导入至细胞中。对于在体外导入，将aav颗粒与从活体获得的细胞接触。随后，所述细胞也可以被移植至活体中。对于将细胞导入至活体，可以将细胞配制为药物组合物，并且可以使用多种技术，诸如肌内、静脉内、皮下和腹膜内施用。对于在体内转导，将aav颗粒配制为药物组合物，并且通常在肠道外施用(例如，通过肌内、皮下、瘤内、经皮肤或脊柱内途径施用)。包括aav颗粒的药物组合物含有药物可接受的载体和，必要的，其它试剂、药物、稳定剂、载体、佐剂、稀释剂等。

36、所述基因导入可为在体外向细胞(如正常细胞或癌细胞)导入目的基因，也可为在体外向组织ptc导入目的基因，还可为在动物体内向组织导入目的基因。在本发明的具体实施方式中，所述细胞包括人胚胎肾细胞(如hek293t)、人类恶性黑色素瘤细胞(如a375)、人结肠癌细胞(如rko)、人宫颈癌细胞(如hela)、人结肠癌细胞(如sw620)、人慢性骨髓性白血病细胞(如k562)、人肝癌细胞(如huh7)、人肺癌细胞(如a549)。所述组织ptc包括乳腺癌ptc、脑瘤ptc。所述动物包含小鼠。

37、另外，用于临床前和临床试验的应用也属于本发明的保护范围，动物如猴子、猪，疾病如应用于眼、脑、肌肉、心脏、肝脏的遗传性疾病，如杜氏肌营养不良症dmd，脊髓性肌萎缩症smn等。

38、第六方面，本发明要求保护如下任一应用：

39、p1、seq id no.1所示多肽在制备前文第一方面中所述腺相关病毒衣壳蛋白变体中的应用；

40、p2、前文第一方面中所述腺相关病毒衣壳蛋白变体或前文第二方面中所述核酸分子或前文第三方面中所述表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系在制备前文第四方面中所述腺相关病毒变体中的应用。

41、第七方面，本发明要求保护如下任一生物材料：

42、q1、seq id no.1所示多肽；

43、q2、编码seq id no.1所示多肽的核酸分子；

44、q3、含有q2中所述核酸分子的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系；

45、q4、重组腺相关病毒，为携带有目的基因的前文第四方面中所述腺相关病毒变体。

46、本发明通过将seq id no.1所示多肽插入腺相关病毒衣壳蛋白的氨基酸序列中，提供了可用于包括癌细胞、人各组织ptc、人各组织包括脑、乳腺等器官的基因转导系统。本发明的aav颗粒对上述器官和细胞具有高细胞侵染，通过aav颗粒转导的基因可以强烈表达。