一种检测TSHR蛋白的核酸适体、衍生物及其应用

一种检测tshr蛋白的核酸适体、衍生物及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种检测tshr蛋白的核酸适体、衍生物及其应用。


背景技术：

2.促甲状腺素受体作为促甲状腺激素(tsh)的受体，在控制甲状腺细胞代谢中起核心作用。这种受体的活性由g蛋白介导激活腺苷酸环化酶。格雷夫斯病(gd)是一种常见的全身性自身免疫性疾病。自从我们现在称为gd的综合征在19世纪早期的医学文献中首次被描述以来，甲状腺的增大和过度活动与眼睛周围结缔组织的炎症和膨胀之间的奇怪联系一直困扰着医学界。直到adams和purves发现长效甲状腺刺激剂，并证明其刺激甲状腺中的腺苷酸环化酶活性，才首次认识到tshr和gd之间的关系。这些抗体现在被称为促甲状腺素免疫球蛋白(tsi)。其中对tshr的免疫耐受性通过尚未确定的机制丧失。这种将tshr误认为“非我”的结果是产生了针对甲状腺上皮细胞上促甲状腺素受体的促甲状腺素免疫球蛋白。
3.促甲状腺素免疫球蛋白直接参与了graves病的发病机制和甲状腺功能亢进，与tshr的相互作用导致不受控制的受体刺激。gd的临床标志是甲状腺的异常生长和过度活动，导致病理性的甲状腺激素水平高。这些增强了目标组织中的氧气消耗和新陈代谢。除了对甲状腺的影响之外，大约20％的真正的gd患者会出现该疾病的眼部表现，称为甲状腺相关眼病(tao)。tao代表了一个结缔组织激活和重塑的过程，这可能导致毁容和失明。在这一过程中，tsi通过甲状腺周围组织中局部表达的tshr发挥作用，与发生在眼眶内的炎症和扩张有关。已经在眼眶脂肪、眼外肌和眼眶成纤维细胞中检测到功能性tshr。因此，有强有力的证据支持tshr和tsi在gd的甲状腺过度活动和眼眶病理学中的作用。另外，已有广泛报道tshr的缺陷也是甲状腺肿瘤(乳头状癌和滤泡癌)的一个原因。(terry smith(2017)：tshr as atherapeutic target in graves’disease，expert opinion on therapeutic targets，doi；10.1080/14728222.2017.1288215)。
4.目前现有靶向促甲状腺素受体抗体5c9抗体k1
–
70，但具有生产成本高，周期长，批次稳定性差，免疫原性，价格昂贵的劣势；(turcuaf，kumar s，neumann s，et al.a small molecule antagonist inhibits thyrotropin receptor antibody-induced orbital fibroblast functions involved in the pathogenesis of graves ophthalmopathy.j clin endocrinolmetab.2013；98(5)；2153-2159.doi；10.1210/jc.2013-1149)小分子化合物ncgc00229600(antag2)/ncgc00242364(antag3)/smas37a/b，但亲和力低(微摩尔)，半衰期短(＜3h)，生物利用率低(50％)的劣势(marcinkowski p，hoyer i，specker e，et al.a new highly thyrotropin receptor-selective small-molecule antagonist with potential forthe treatment ofgraves'orbitopathy.thyroid.2019；29(1)；111-123.doi；10.1089/thy.2018.0349)。
5.核酸适体具有体积小、特异性强、稳定性高、免疫原性低、易于修饰、构建靶向递送等优点，具有作为靶向识别、标记tshr蛋白的潜力。核酸适体是具有20～100个核苷酸长度
的单链dna或rna，通过指数富集(selex)方法对配体进行系统进化筛选得到，可以形成三维结构特异地结合到目标分子上。核酸适体最显著的特征如下：
6.1)首先，适体介导的分子识别具有很高的特异性，可以用于区分细微的分子差异。对这一概念的证明是使用适体来区分三种不同但密切相关且形态相似的急性髓系白血病(aml)细胞。这种准确区分分子特征的能力，有助于阐明发病机制相关的分子基础。
7.2)cell-selex是为了能够模拟真实环境中的活细胞而开发的，它能够为任何感兴趣的细胞生成适体，而不需要依赖其先前的分子特征知识。因此，cell-selex可用于发现以前未知的生物标志物，或其在发病机制中尚未被认识的特征；
8.3)核酸适体易于修饰，可增强其体内稳定性；同时能偶联其他药物、分子或纳米颗粒，与细胞膜上的受体结合后，能介导自身或偶联颗粒进入细胞，可作为药物递送的理想靶向分子工具。
9.然而，目前还没有促甲状腺素受体特异性核酸适体的报道。


技术实现要素：

10.本发明的主要目的是旨在克服现有的技术不足，提供一种检测tshr蛋白的核酸适体、衍生物及其应用，以及在该方法中使用的核酸适体构建识别靶标蛋白tshr制剂和靶向载药制剂的应用该适体制备简单，成本低，对促甲状腺素受体蛋白选择性好，结合力强，检测灵敏度高，检测过程操作简单，结果准确。
11.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
12.本发明提供了一种检测tshr蛋白的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列如seq no 1所示。
13.本发明还提供了所述检测tshr蛋白的核酸适体的衍生物，所述衍生物是将所述核酸适体序列的两端或一端进行包括：放射性标记、治疗性药物连接、荧光标记或生物素标记，得到与所述核酸适体具有相同结合tshr能力的核酸适体衍生物。
14.本发明还进一步提供了所述检测tshr蛋白的核酸适体的衍生物，所述衍生物是将所述核酸适体序列删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。
15.本发明还进一步的提供了所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体，所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体的衍生物，在制备tshr蛋白检测试剂中的应用。
16.本发明还进一步的提供了所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体，所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体的衍生物，在制备tshr靶向载体试剂中的应用。
17.本发明还进一步的提供了所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体，所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体的衍生物，在研究相对高表达tshr细胞和相对低表达tshr细胞之间的差异化中的应用。
18.本发明还进一步的提供了所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体，所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体的衍生物，在研究tshr蛋白活体标记中的应用。
19.本发明还进一步的提供了所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体，所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体的衍生物，在构建甲状腺疾病靶向载药制剂的应用。
20.优选的，所述甲状腺疾病为甲状腺结节、甲状腺功能亢进症、慢性淋巴细胞性甲状
腺炎、甲状腺弥漫性病变、甲状腺功能减退和甲状腺异常中的一种。
21.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
22.1、本发明利用cell-selex筛选技术，通过慢病毒将tshr质粒转染入293t细胞(tshr-293t)，构建高表达tshr蛋白的模型细胞，而慢病毒将空载质粒转染入293t细胞(mock)作为负筛细胞，消除与293t细胞非特异性结合的dna，确保筛选得到的核酸适体特异性识别tshr蛋白。以活细胞作为靶标的筛选保证筛选得到的核酸适体识别靶分子的天然构象。
23.2、本发明所述靶向tshr的核酸适体具有独特的茎环结构，并通过流式检测发现其具有较高的结合亲和力和特异性，能特异性识别tshr-293t细胞，不识别293t细胞。筛选获得的核酸适体可以进一步截短优化，分子量小，节约了合成成本，提高了亲和力，易修饰改造，无细胞毒性，结合特异型强，无免疫原性，稳定性高。上述优点使得所述核酸适体作为tshr蛋白特异性识别分子探针，用于诊断和靶向调节tshr蛋白相关疾病具有重要的潜力。
24.3、本发明提供了一种通过tshr蛋白高亲和dna适体yc6，并在分子水平细胞水平组织水平中得到验证。本发明认为dna适体yc6具有识别靶向表达促甲状腺素受体细胞的作用，为甲状腺疾病与甲状腺相关性眼病提供新的疾病诊断和治疗提供新的思路。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
26.图1为流式检测所得核酸适体yc6与tshr-293t以及mock的结合情况；
27.其中横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数目。
28.图2为荧光显微镜检测适体yc6与甲状腺相关性眼病患者眼眶脂肪结缔组织的结合情况；
29.tshrab代表tshr抗体荧光信号，yc6-cy3代表cy3荧光素修饰的适体荧光信号，dapi代表细胞核荧光信号，merge代表适体、抗体与细胞结合的合并荧光信号。
30.图3为琼脂糖凝胶对核酸适体yc6的稳定性表征。
31.图4为所述核酸适体的茎环结构图。
具体实施方式
32.本发明提供了一种检测tshr蛋白的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列accgaccgtgctggactcactcgcaagggcactttttttaggtcgactatgagcgagcctggcg如seq no 1所示。
33.在本发明中，所述检测tshr蛋白的核酸适体yc6在25℃，1.0mm na
+
，0.5mm mg
2+
条件下具有独特的茎环结构，其结构式如图4所示。
34.本发明还提供了所述检测tshr蛋白的核酸适体的衍生物，所述衍生物是将所述核酸适体序列的两端或一端进行包括：放射性标记、治疗性药物连接、荧光标记或生物素标记，得到与所述核酸适体具有相同结合tshr能力的核酸适体衍生物。
35.本发明还进一步提供了所述检测tshr蛋白的核酸适体的衍生物，所述衍生物是将
所述核酸适体序列删除或增加一个或几个核苷酸，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。
36.本发明还进一步的提供了所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体，所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体的衍生物，在制备tshr蛋白检测试剂中的应用。
37.本发明还进一步的提供了所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体，所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体的衍生物，在制备tshr靶向载体试剂中的应用。
38.本发明还进一步的提供了所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体，所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体的衍生物，在研究相对高表达tshr细胞和相对低表达tshr细胞之间的差异化中的应用。
39.本发明还进一步的提供了所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体，所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体的衍生物，在研究tshr蛋白活体标记中的应用。
40.本发明还进一步的提供了所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体，所述的一种检测tshr蛋白的核酸适体的衍生物，在构建甲状腺疾病靶向载药制剂的应用。
41.在本发明中，所述甲状腺疾病为甲状腺结节、甲状腺功能亢进症、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺弥漫性病变、甲状腺功能减退和甲状腺异常中的一种。
42.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
43.细胞来源：以下实施例所用到的原代细胞从甲状腺相关性疾病患者眼眶减压术中分离的脂肪结缔组织中提取获得；人胚肾细胞系(293t)购自中国武汉普诺赛生命科技有限公司。
44.实施例1以cell-selex技术筛选所述核酸适体yc6，流式检测所得核酸适体yc6与tshr-293t以及mock的结合情况。
45.(1)所用核酸文库和引物的设计：
46.随机单链dna文库：
[0047]5’‑
accgaccgtgctggactca(n)42actatgagcgagcctggcg-3’(n代表a、t、g、c四种任意碱基，42代表有42个n也就是有42个随机的碱基)(seqno.2)
[0048]
上游引物：5
’‑
异硫氰酸荧光素-accgaccgtgctggactca-3’(seqno.3)
[0049]
下游引物：5
’‑
生物素-cgccaggctcgctcatagt-3’(seq no.4)
[0050]
(2)筛选过程：
[0051]
本发明以高表达tshr的tshr-293t为正筛靶标，以不表达tshr的mock细胞为反筛靶标。
[0052]
1、正筛选：
[0053]
a.孵育：用结合缓冲液溶解上述随机dna文库，95℃变性5min，冰上复性10min，然后与预处理好的培养48h以上细胞融合度达90％左右的tshr-293t在4℃共孵育1h。
[0054]
b.分离：将孵育后上清移除，用洗涤缓冲液冲洗孵育后细胞数次，随后取无菌水刮取洗涤后细胞与离心管，95℃变性10min，冰上复性10min，5500rpm离心3min，吸取上清即分离得到tshr-293t细胞的第一轮筛选核酸文库。
[0055]
c.pcr扩增文库：以步骤b中得到的文库为模板，上述引物为引物，扩增条件为：95℃，30s；55.9℃，30s；72℃，30s扩增8个循环，72℃，5min。得到初步扩增产物，而后以扩增产
物为模板扩增合适循环数进行大量扩增。d.dna单链制备：用链霉亲和素修饰的琼脂糖珠分离生物素标记的步骤c中的pcr扩增产物反义链，而后以0.2m的naoh将dna双链变性，通过脱盐收集异硫氰酸荧光素标记的正义dna单链文库。
[0056]
2、反筛：将步骤d中所得到的dna单链文库与反筛细胞mock细胞进行孵育，收集孵育后上清，以排除非特异性结合的核酸分子，收集上清可继续与正筛细胞孵育以进行下一筛选步骤。
[0057]
3、筛选过程的循环：重复步骤1和步骤2的筛选过程，直至筛选到与靶细胞tshr-293t细胞结合较强的核酸适体文库。此过程需进行几轮到十几轮的重复。
[0058]
4、高通量测序：将筛选最后一轮结合最大的核酸文库进行高通量测序，利用流式检测所得序列与tshr-293t细胞的结合能力，从而确定核酸适体。
[0059]
首先，分别培养tshr-293t和mock48h使细胞密度达90％，再分别用0.2％edta将贴壁状态的细胞从培养皿上消化下来。分别用200μl结合缓冲液配置250nm的合成好的fam标记的yc6，95℃变性5min，冰上复性10min。与30万个tshr-293t或mock细胞在4℃共孵育45min。使用洗涤缓冲液洗涤孵育后的细胞2～3次，而后将细胞重悬于300μl洗涤缓冲液中。通过流式细胞仪术进行荧光检测，dna初始随机文库作为对照。核酸适体只结合靶细胞tshr-293t，不结合mock，结果如图1所示。
[0060]
图1：横坐标fam代表荧光信号，纵坐标是细胞的数量。适体修饰fam荧光。将筛选获得的适体链分别与正负细胞孵育，由图1可看出适体yc6使正细胞荧光信号增强，但没有对于负细胞没有明显增强。
[0061]
实施例2荧光显微镜检测适体yc6与甲状腺相关性眼病患者眼眶脂肪结缔组织的结合情况
[0062]
将甲状腺相关性眼病患者眼眶脂肪结缔组织取适当大小进行固定、脱水、包埋等制作石蜡切片，再进行脱蜡，抗原修复封闭等步骤后，用tshr抗体((1：1000，abcam，ab27974))孵育切片过夜，洗涤3次后孵育二抗goat anti-mouse second antibodyaf488(1；400，bioss)，用500μl结合缓冲液配置250nm的合成好的cy3标记的yc6，95℃变性5min，冰上复性10min，而后与切片4℃共孵育45min，洗涤3次，用含dapi封片液封片。荧光显微镜检测在340nm波长，488nm波长，570nm波长的荧光信号，结果如图2所示。
[0063]
图2：荧光显微镜检测适体yc6与甲状腺相关性眼病患者眼眶脂肪结缔组织的结合情况。
[0064]
dapi：染核试剂
[0065]
tshrab：goat-anti，mouse，tshr，antibody
[0066]
yc6-cy3；cy3荧光素修饰的yc6适体
[0067]
merge；信号叠加
[0068]
实施例3以琼脂糖凝胶对核酸适体yc6的稳定性表征
[0069]
首先，将合成好的核酸适体yc6溶解于含10％fbs的dmem完全培养基中，终浓度为3μm，于37℃分别孵育0h，1h，2h，4h，6h，12h，24h，48h，95℃变性5min，冰上复性10min，而后保存于-80℃。用3％的琼脂糖凝胶电泳检测上述样品的稳定性。和0h相比，yc6于完全培养基中孵育48h仍未明显降解，稳定性较强，结果如图3所示。
[0070]
图3：以琼脂糖凝胶对核酸适体yc6的稳定性表征。
[0071]
核酸适体yc6溶解于含10％fbs的dmem完全培养基中，终浓度为3μm，于37℃分别孵育0h，1h，2h，4h，6h，12h，24h，48h，95℃变性5min，冰上复性10min，而后保存于-80℃。用3％的琼脂糖凝胶电泳检测上述样品的稳定性。和0h相比，yc6于完全培养基中孵育48h仍未明显降解，稳定性较强。
[0072]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。