一种用于脂肪间充质干细胞体外分化的高效低成本培养基的制作方法

本发明属于干细胞和动物细胞培养肉，具体地，涉及一种用于脂肪间充质干细胞体外分化效率更高、成本价格更低的、能够安全用于食品使用的培养基。

背景技术：

1、细胞培养肉是依据动物肌肉以及脂肪生长机理，利用其干细胞进行体外培养而获得的肉类，它不需要经过动物养殖，直接用细胞工厂化生产肉类。细胞培养肉作为一种颠覆性肉类生产方式为补充未来肉类蛋白供应、实现肉类绿色生产提供了新的途径。根据测算，相较于传统的畜牧业，细胞培养肉产业能减少35％到60％的能耗、少占用98％的土地和少产生80％以上的温室气体。

2、脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells)是一种具有增殖和向成熟脂肪细胞分化能力干细胞。近年来各种诱导方法和诱导因子对脂肪间充质干细胞进行诱导分化获得成功，其中大多采用胰岛素、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、罗格列酮和吲哚美辛等激素进行联合诱导。

3、相似地，培养肉在体外生产过程需要建立诱导脂肪间充质干细胞高效地向成熟脂肪细胞分化的方法，因此选择一种优良的细胞分化培养基是培养肉生产过程中的关键一环，直接影响脂滴的产生。

4、目前广泛使用的诱导脂肪间充质干细胞向成熟脂肪细胞分化的培养基配方是dmem/f12基础培养基加入10％牛血清和1％双抗并且使用3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松、吲哚美辛以及罗格列酮五种诱导剂进行联合诱导。该培养基在分化第10天左右能达到较好的分化效果。但是该培养基由于一些化学成分如3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、吲哚美辛以及罗格列酮的添加，导致潜在的毒性较强，不符合食品安全相关要求，并且存在成本昂贵等问题。此外，该培养基条件下的脂肪细胞分化效率不尽人意。因此，利用油脂油酸以及常见的维生素c、维生素b、维生素k、和低浓度胰岛素，开发一种能够安全用于食品使用，降低价格成本，并且能够促进脂肪间充质干细胞高效分化的培养基变得尤为重要。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是替代传统分化培养基中的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松、吲哚美辛以及罗格列酮这四种成分并降低传统分化培养基中的胰岛素使用量，通过油脂油酸以及维生素c、维生素b、维生素k以及低浓度胰岛素，提供一套能够安全用于食品使用，降低价格成本，并且能够促进脂肪间充质干细胞高效分化的改良分化培养基及其应用方法。

2、本发明提供了一种能够安全用于食品使用，降低价格成本，并且促进脂肪间充质干细胞高效分化的改良分化培养基。所述添加有细胞培养补充因子的改良分化培养基均可在通用培养基中直接添加制备获得。其中，通用培养基可选自各常规的细胞培养基，如dmem、mem、dmem/f12、f10等，本发明实施例子均采用dmem/f12培养基添加细胞培养补充因子。

3、所述添加的促成脂分化因子可以选自以下细胞补充因子中的多种：胰岛素、油脂(大豆油)、维生素c、维生素b、维生素k、油酸等。

4、进一步的，所述添加有细胞培养补充因子的细胞培养基中均含有青霉素-链霉素双抗溶液，青霉素的含量均为10000u/ml，链霉素的含量均为10mg/ml。

5、所述添加有细胞培养补充因子的细胞培养基中，所述添加的细胞培养补充因子总浓度不低于50mg/ml，较佳地为100-1500mg/ml。

6、进一步的，所述添加有细胞培养补充因子的细胞培养基中，任一添加的细胞培养补充因子的浓度在0.5ng/ml-0.2mg/ml的范围内。

7、本发明第三方面，提供了前述高效低成本的成脂分化培养基在脂肪间充质干细胞体外分化培养中的应用方法，包括下列步骤：

8、1)取经过纯化后的脂肪间充质干细胞。

9、2)在培养皿中添加重组人成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor,bfgf)扩增脂肪间充质干细胞至90％以上的密度；

10、3)吸去脂肪间充质干细胞增殖培养基后，重新补充新的添加有成脂分化因子的细胞培养基，继续培养；

11、4)8天后采用吸去培养基后，添加仅含有胰岛素的维持分化培养基，继续培养；

12、5)10天后脂肪细胞产生大量脂滴。

13、进一步的，前述细胞培养的环境条件为在co2培养箱中37℃培养，co2培养箱中co2浓度为5％(v/v)。

14、进一步的，步骤2)中所采用的脂肪间充质干细胞增殖培养基为10vol％胎牛血清、89vol％f12培养基、1vol％的青霉素链霉素双抗以及5ng/ml bfgf。

15、现有的脂肪间充质干细胞分化培养基包含的一些不符合食品安全相关要求的化学成分较多，潜在的毒性较强，在生物化学、医学、食品科学等方面的应用都有所局限，且诱导脂肪间充质干细胞分化效率较低，无法充分利用脂肪间充质干细胞的分化潜能。采用本发明的添加有油脂油酸以及维生素的脂肪间充质干细胞分化培养基，与旧配方相比，在分化第5天能够提高pparγ基因的相对表达量1.49(±0.83)倍，在分化第10天提高fabp4基因的相对表达量2.48(±0.75)倍。在分化第10天提高plin1基因的相对表达量1.62(±0.62)倍。

16、在分化第5天能够提高pparγ蛋白的相对表达量1.49(±0.83)倍，在分化第10天能够提高fabp4蛋白的相对表达量1.97(±0.06)倍；在分化第10天能够提高plin1蛋白的相对表达量1.82(±0.06)倍。在终末分化阶段的细胞分化效果更好，诱导分化形成的脂滴更多，更饱满,所述的细胞分化培养基能提高细胞分化百分比，传统的分化培养基在分化第十天分化效率仅达到11.67％(±0.02)，而改良的分化培养基在分化第十天分化效率可达到29.38％(±0.02)，存在极显著差异(p＜0.001)，是传统分化培养基分化效率的2.5倍。以上分化性能的提高，为脂肪间充质干细胞更高效地分化为成熟的脂肪细胞，为3d培养脂肪间充质干细胞生产细胞培养肉提供了减少无食品安全使用史的化合物，降低价格成本，并且能够促进脂肪间充质干细胞高效分化的方法。

17、本发明技术方案所实现的有益效果为：

18、细胞培养肉生产的关键一环是脂肪间充质干细胞进入分化进程，细胞产生甘油三酯，并凝聚成脂滴，但是目前现有的促成脂分化培养基存在无食品安全使用史的化合物、潜在毒性较强、分化效率低、成本昂贵等缺点，这意味运用该分化培养基无法大规模高效、稳定、低成本地生产细胞培养肉，严重阻碍了细胞培养肉产业化的进程。

19、本发明可安全用于食品使用，价格成本低，并且能够促进脂肪间充质干细胞高效分化的培养基，通过油酸油脂以及维生素c、维生素b、维生素k的添加，代替传统诱导剂在分化培养基中的使用，在体外诱导脂肪间充质干细胞分化中提高了脂肪间充质干细胞的分化效率，激发其分化潜能，同时能够产生更多的甘油三酯，形成更多的脂滴。该化学成分安全的脂肪间充质干细胞分化培养基在3d生产细胞培养肉时，也能提供更高的分化效率，表达更多的成脂分化相关蛋白，生产出品质更高的细胞培养肉。