一种抑制肝细胞凋亡的表面分子及其应用

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种肝细胞表面分子cd1d(cluster ofdifferentiation 1d)在高表达或通过抗体激活后可有效抑制肝细胞凋亡，可作为急慢性肝病中预防和/或治疗肝损伤药物中的应用。

背景技术：

1、全球超过10亿人、中国超过3亿人罹患肝病，严重危害人类健康。肝细胞是肝脏中最主要的细胞群，是各种急慢性肝病中的主要损害靶标。肝细胞凋亡是由多个基因共同调控的一种程序性细胞死亡。正常生理情况下，肝细胞可通过凋亡这种“自我破坏”的方式去除衰老或损坏的肝细胞，从而有利于维持肝脏稳态。但另一方面，多种损伤因素也会诱导肝细胞发生过度凋亡，从而介导了多种急慢性肝病的发生、发展，例如中毒、病毒性肝炎、脂肪性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎、自身免疫、胆汁淤积性肝炎、缺血再灌注性损伤等。但目前临床上仍缺乏有效的改善肝细胞抗凋亡能力从而控制肝脏损伤的干预手段。

2、cd1d(分化抗原簇1d，cluster of differentiation 1d)，与mhc-i类分子高度同源，属非经典mhc-i类似分子(non-classical mhc class i-like molecule)，表达于多种细胞表面。表达于抗原递呈细胞的cd1d可通过递呈脂类抗原激活nkt细胞而促进组织炎症。cd1d也组成性表达于一些组织细胞，如肝细胞、肠上皮细胞等，近年的研究提示组织细胞cd1d主要参与维持局部微环境的稳定。

3、目前进入临床实验的抗肝细胞凋亡药物主要是针对肝损伤发生时激活或执行凋亡的关键酶(如caspase家族分子)的化学抑制剂(如emricasan、vx-166等)，即肝损害已显著发生时才会出现的病理性靶标，因此仅适用于治疗；目前临床研究提示，此类治疗效果欠佳且维持时间短，且化学药物的毒副作用可能使部分患者甚至出现进一步肝损，导致病情加重。而本发明通过如下技术方案可预先或主动特异性增强肝细胞抗凋亡能力，因此不仅适用于治疗，还对肝损伤有一定的预防价值，且作用机制特异故而理论上毒副作用也可能较小。

技术实现思路

1、本发明针对目前临床上缺乏特异性提高肝细胞抗凋亡能力的手段，提供了一种可方便、有效地提高肝细胞抗凋亡和抗损伤能力的细胞表面干预靶标，今后可通过病毒载体靶向提高肝细胞cd1d表达水平或用单克隆抗体或小分子药物特异性激活肝细胞表面cd1d，从而应用于临床上急慢性肝病中肝损伤的预防和治疗。

2、本发明技术方案如下：

3、本发明的第一个目的是提供一种抑制肝细胞凋亡的表面分子，所述表面分子为肝细胞cd1d蛋白分子。

4、进一步的，人cd1d蛋白分子全长氨基酸序列如seq.id.no.1所示，小鼠cd1d蛋白分子全长氨基酸序列如seq.id.no.2所示。

5、在某个特殊的实施例中，编码cd1d蛋白的核苷酸序列如seq id no.3所示。

6、本发明的第二个目的是提供前述的表面分子作为干预靶标在制备、开发或筛选药物或试剂中的应用，所述药物或试剂的功能包括如下至少一种：

7、(1)预防和/或抑制肝细胞凋亡；

8、(2)预防和/或抑制肝细胞损伤；

9、(3)预防和/或抑制肝细胞凋亡执行分子caspases的激活；

10、(4)增加肝细胞抗凋亡蛋白分子的表达。

11、进一步的，所述抗凋亡蛋白分子为bcl-xl、bcl-2。

12、本发明公开的肝细胞cd1d作为干预靶标，目前可通过如下技术方案实现增强肝细胞抗凋亡能力和抑制肝损伤的作用：

13、(1)通过肝细胞定向的病毒载体高表达cd1d；

14、(2)通过单克隆抗体特异性激活cd1d。

15、本发明公开了以肝细胞cd1d作为干预靶标，通过病毒载体在肝细胞定向高表达cd1d，在hfd(高脂饮食，high-fat diet)和mcd(蛋氨酸胆碱缺乏饮食，methionine-cholinedeficient diet)所诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，nash)中抑制肝细胞凋亡和减轻慢性肝损害的应用。

16、本发明公开了以肝细胞cd1d作为干预靶标，通过anti-cd1d单克隆抗体(克隆号：19g11)在fas(第一凋亡信号受体，first apoptosis signal receptor，cd95)诱导的小鼠急性肝损伤(模拟临床病毒型肝炎、酒精性肝炎、中毒性肝炎、药物性肝炎等多种急性发作的肝损伤)中抑制肝细胞凋亡和减轻肝损害的应用。

17、本发明的第三个目的是提供激活cd1d或提高肝细胞cd1d表达水平的药物或试剂在制备抑制肝细胞凋亡药物中的应用。

18、进一步的，所述肝细胞凋亡为非酒精性脂肪性肝炎所致的肝细胞凋亡。

19、本发明的第四个目的是提供激活cd1d或提高肝细胞cd1d表达水平的药物或试剂在制备肝病中预防和/或治疗肝细胞损伤药物中的应用。

20、进一步的，所述肝损伤为急性肝细胞损伤或慢性肝细胞损伤。

21、进一步的，本发明所述药物或试剂为肝细胞定向的cd1d1过表达载体或cd1d单克隆抗体。

22、进一步的，本发明所述cd1d1过表达载体为基于腺相关病毒构建的。

23、本发明首次观察到临床nash患者及实验室nash小鼠模型中，肝细胞cd1d表达水平发生大幅度下降。

24、通过aav8病毒载体(含肝细胞特异性启动子tbg)在nash小鼠肝细胞定向高表达cd1d后发现，与对照组相比，nash小鼠肝细胞凋亡程度、肝脏炎症、肝纤维化程度、肝细胞损伤程度均显著减轻(均为p＜0.05)。

25、给小鼠提前注射anti-cd1d单克隆抗体(克隆号：19g11)激活肝细胞cd1d，然后通过注射fas激动型抗体诱导小鼠发生急性凋亡性肝损伤(模拟临床病毒型肝炎、酒精性肝炎、中毒性肝炎、药物性肝炎等多种急性肝损伤)，结果显示小鼠肝细胞凋亡及肝损伤程度均显著减轻(均为p＜0.05)。

26、此外，本发明通过使用一种饱和脂肪酸(软脂酸，palmitic acid，pa)(模拟脂肪性肝炎中的脂毒性)以体外诱导肝细胞(aml12小鼠肝细胞株)发生凋亡的同时，使用anti-cd1d(克隆号：19g11)体外激活肝细胞cd1d，结果显示激活cd1d可显著增加肝细胞抗凋亡蛋白(bcl-xl、bcl-2)的表达，同时显著减轻肝细胞凋亡程度。

27、基于如上，肝细胞表面分子cd1d作为干预靶标，在高表达或激活后，可增强肝细胞抗凋亡能力，从而可用于预防或减轻急慢性肝病中因肝细胞过度凋亡而导致的肝损伤。

28、因此，本发明方案能够有效解决目前已进入临床实验的化学药物抑制剂(如emricasan、vx-166等)主要针对执行或调节凋亡的关键酶，即肝损害已显著发生时才会出现的病理性靶标，因此仅适用于治疗，且目前临床证据提示治疗效果欠佳且维持时间短，甚至部分患者出现肝损加重(可能是药物的毒副作用)的系列临床问题。本发明通过如上技术方案可预先或主动特异性增强肝细胞抗凋亡能力，因此不仅可用于治疗，还可用于预防，且作用机制特异故而理论上毒副作用也可能较小。

29、本发明通过病毒载体靶向提高肝细胞cd1d表达水平或通过单克隆抗体特异性激活cd1d，可显著增强肝细胞的抗凋亡能力，从而可预防或减轻由肝细胞过度凋亡引起的肝损伤。

30、本发明基于临床肝病患者肝细胞cd1d的变化特点而制定干预策略，不仅有利于探索肝病的发病原因和机制，还可针对性地提高肝病患者肝细胞抗凋亡和抗损伤的能力。