一种用于检测鸠宁病毒的crRNA靶点及CRISPR-Cas13a系统

本发明属于分子诊断，涉及一种用于检测鸠宁病毒的crrna靶点及crispr-cas13a系统。

背景技术：

1、鸠宁病毒属于沙粒病毒科沙粒病毒属，新世界组类病毒，是阿根廷出血热的病原体。鸠宁病毒为核糖核酸(rna)病毒，直径60～280纳米，平均110～130纳米，呈球型，扁球型或多样型。外膜上有2～10个长约6纳米，球棒状突起物，毒粒内含2～10个直径20～25纳米沙粒状颗粒。鸠宁病毒可以在哨齿类动物中慢性长期感染，而这些哨齿类动物在它们的自然栖息地中广泛存在。人类通过粘膜暴露、飞沫或是破损皮肤与感染物质的直接接触而感染疾病。人与人之间的传染十分罕见，但也可能通过直接接触患者的已感染组织液而患病，医院中的感染曾有报道。大面积的感染病例主要发生于阿根廷的收获季节，但在五月份也会出现小规模的感染高峰。该疾病在男性中的发病概率是在女性中的四倍，且城市人口感染概率大大低于农村人口。每年，阿根廷出血热发生率与旱地暮鼠栖息地人口密度正相关。这种疾病的流行病学特征可以通过对高风险人群接种疫苗来进行缓和，目前主要检测技术为荧光定量pcr法，该方法稳定、可靠、具有一定的灵敏度，但样本处理复杂，且对仪器要求高。

2、2017年4月，美国研究人员建立了一种灵敏度达到埃摩级(单拷贝)，特异性达到单碱基的核酸检测技术——基于crispr-cas13a的核酸检测平台sherlock(specific highsensitivity enzymatic reporter unlocking)，利用leptotrichia wadei cas13a蛋白(lwcas13a)的非特异剪切活性，结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)，实现了对痕量核酸快速、廉价、高灵敏的检测。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是提供一种用于检测鸠宁病毒的crispr-cas13a系统。

2、本发明提供的用于检测鸠宁病毒的crispr-cas13a系统包括cas13a蛋白和crrna，或二者形成的复合体；

3、所述crrna包括用于与cas13a蛋白结合的锚定序列和靶向鸠宁病毒靶点序列的向导序列；

4、所述鸠宁病毒的靶点序列为序列1。

5、上述crispr-cas13a系统中，所述crrna序列为序列2。其中，序列2第1-38位为用于与cas13a蛋白结合的锚定序列；序列2第39-66位为靶向鸠宁病毒靶点序列的向导序列。

6、上述crispr-cas13a系统中，所述cas13a蛋白为lwcas13a蛋白。

7、本发明的第二个目的是提供一种用于检测鸠宁病毒的试剂盒。

8、本发明提供的用于检测鸠宁病毒的试剂盒包括上述用于检测鸠宁病毒的crispr-cas13a系统。

9、进一步的，所述试剂盒还包括用于特异性扩增鸠宁病毒靶点序列的引物对；所述引物对由序列4所示的单链dna分子和序列5所示的单链dna分子组成。

10、更进一步的，所述试剂盒还包括用于特异性扩增鸠宁病毒靶点序列的其他试剂和用于检测扩增产物的其他试剂。所述用于特异性扩增鸠宁病毒靶点序列的其他试剂包括缓冲液和/或ddh2o；所述用于检测扩增产物的其他试剂包括如下试剂中的全部或部分：lwcas13a蛋白、ntp(如ntp mix)、t7 rna聚合酶、rna酶抑制剂、报告rna(rnase alert v2，报告rna是具有信号报告功能的rna分子)、rnase free water。

11、所述试剂盒还可包括记载有如下判定标准甲或判定标准乙的载体：

12、crispr-cas13a荧光检测体系的判定标准甲：若在同一检测时间内，待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照(ddh2o)荧光强度值高3倍以上(包括待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照荧光强度值高3倍的情况)，或任何时候待测样本检测体系的荧光强度值大于或等于0.1a.u.，则待测样本含有或候选含有鸠宁病毒，否则待测样本不含有或候选不含有鸠宁病毒。

13、crispr-cas13a荧光检测体系的判定标准乙：检测反应后体系滴在试纸上后2-5分钟进行判读，若试纸没有“t”线显现且有“c”线显现，则待测样本含有或候选含有鸠宁病毒；若试纸有“t”线显现且有“c”线显现，则待测样本不含有或候选不含有鸠宁病毒；若试纸没有“c”线显现，则试纸失效，需更换试纸重新实验。

14、本发明的第三个目的是提供如下任一物质：

15、a1)上述crrna；

16、a2)上述cas13a蛋白和crrna，或者二者形成的复合体；

17、a3)上述引物对。

18、本发明的第四个目的是提供如下任一应用：

19、b1)上述系统或上述试剂盒或上述物质在检测或辅助检测鸠宁病毒或其核酸中的应用；

20、b2)上述系统或上述试剂盒或上述物质在制备检测或辅助检测鸠宁病毒的产品或其核酸中的应用；

21、b3)上述系统或上述试剂盒或上述物质在检测或辅助检测待测样本中是否含有鸠宁病毒或其核酸中的应用；

22、b4)上述系统或上述试剂盒或上述物质在制备检测或辅助检测待测样本中是否含有鸠宁病毒或其核酸的产品中的应用；

23、b5)上述系统或上述试剂盒或上述物质在筛选或辅助筛选鸠宁病毒防治药物中的应用；

24、b6)上述系统或上述试剂盒或上述物质在制备筛选或辅助筛选鸠宁病毒防治药物的产品中的应用；

25、b7)上述物质在制备上述试剂盒中的应用。

26、本发明的最后一个目的是提供一种检测或辅助检测鸠宁病毒的方法。

27、本发明提供的检测或辅助检测鸠宁病毒的方法包括如下步骤：

28、c1)以待测样本的核酸为模板，采用由序列4所示的单链dna分子和序列5所示的单链dna分子组成的引物对进行raa扩增，得到raa产物；

29、c2)配制含有如下组分的crispr-cas13a检测体系：所述raa产物、cas13a蛋白、上述crrna、报告rna、ntp、t7 rna聚合酶和rna酶抑制剂；同时以水(ddh2o)替代所述raa产物作为阴性对照；

30、c3)将所述crispr-cas13a检测体系反应，检测反应产物，从而判断待测样本是否含有鸠宁病毒。

31、上述反应为荧光体系反应c3)-1或试纸条体系反应c3)-2：

32、c3)-1：所述crispr-cas13a检测体系，且crispr-cas13a检测体系中的rna为荧光报告rna，将该crispr-cas13a检测体系放入荧光定量pcr仪中反应，检测荧光强度，根据荧光强度的大小判定所述待测样本中是否含有鸠宁病毒：若在同一检测时间内，待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照荧光强度值高3倍以上(包括待测样本检测体系的荧光强度值比阴性对照荧光强度值高3倍的情况)，或任何时候待测样本检测体系的荧光强度值大于或等于0.1a.u.，则待测样本含有或候选含有鸠宁病毒，否则待测样本不含有或候选不含有鸠宁病毒。

33、c3)-2：所述crispr-cas13a检测体系进行反应，且crispr-cas13a检测体系中的rna为试纸检测的报告rna，用试纸检测反应产物，根据“t”线是否消失且“c”线显现判定所述待测样本中是否含有鸩宁病毒：若在同一检测时间内，待测样本检测体系的“t”线消失且“c”线显现，则待测样本含有或候选含有鸩宁病毒，否则待测样本不含有或候选不含有鸩宁病毒。

34、进一步的，步骤c1)中，所述raa扩增的反应条件为：42℃反应20-40分钟；

35、步骤c3)-1中，所述反应的条件为：37℃，每2min读取一次荧光强度值，读取40次。

36、上文中步骤c3)-2中，所述反应的条件为：37℃，反应30min。

37、更进一步的，所述待测样本可为血液样本、器官(如肝、脾、肾等)组织样本、细胞等。

38、本发明所提供的检测或辅助检测鸠宁病毒的方法既可为非疾病诊断治疗方法，也可为疾病诊断治疗方法。其中，所述非疾病诊断治疗方法可如在细胞水平筛选鸠宁病毒防治药物时检测用药前后细胞内是否含有鸠宁病毒。

39、本发明基于crispr-cas13a核酸检测技术，通过设计、构建、筛选，最终提供一段用于鸠宁病毒检测的靶点序列及能靶向该靶点序列的特异性crrna，该crrna可通过激活cas13a实现对鸠宁病毒核酸的高灵敏、高特异检测，灵敏度达到单拷贝(1copy/μl)。