红球菌Z13菌株及其应用

红球菌z13菌株及其应用
【技术领域】
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及红球菌z13菌株及其应用。


背景技术：

2.苯酚是重要的化工原料,被广泛应用于酚醛树脂、炼油、焦碳、染料、纺织、杀虫剂、农药和医药的生产中，并成为这些工业废水中的主要污染物。含酚废水的排放对环境造成严重的污染，危害人类健康及生物的生长繁殖，因此许多国家将其列入环境优先控制污染物黑名单。目前对含酚废水的处理方法主要有吸附、萃取、氧化还原和生物降解等方法。其中生物降解法是利用自然界中能利用苯酚作为碳源生长的微生物降解污水中的酚类污染物，其整个过程基本是在微生物酶参与下发生的生物化学反应，具有适应性广，能耗少，处理效率高，二次污染少，投资少等优点，是目前废水处理领域中较为先进和重要的方法。
3.近年来，国内外已分离鉴定的苯酚降解微生物主要包括细菌和真菌两大类。细菌主要包括假单胞菌属(pseudomonas sp.)、芽孢杆菌属(bacillus sp.)、产碱菌属(alcaligens sp.)和红球菌属(rhodococcus sp.)；真菌主要包括酵母菌属(saccharomyces sp.)、假丝酵母属(candida sp.)和不动杆菌属(acinetobacter sp.)。降解活性多在300-1000mg/l，随着苯酚浓度的增大，会极大地抑制微生物的活性，且降解周期偏长，限制大多数微生物在污水处理中的应用。因此，分离筛选得到既能降解高浓度苯酚、且降解效率高的微生物意义重大。
4.现有技术中，也有研究部分红球菌菌株也能降解苯酚，但是降解速率不一。另外，在实际生产生成的含有苯酚的废水刚排出的温度过高，菌株降解能力极易被破坏。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供了一株新的红球菌z13菌株及其应用。
6.为达到上述目的，本发明筛选得到一株红球菌(rhodococcus sp.)z13菌株，其保藏编号为gdmcc no.62880，保藏日期：2022年10月13日，保藏地址为：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)。
7.本发明的红球菌z13菌株(rhodococcus ferula)来源于广西柳州市三江县甘蔗地的土壤样品，将筛选得到的菌株提取基因组dna，使用通用引物27f和1492r进行pcr扩增，测序，得到的16s rrna基因序列提交到ezbiocloud比对。结果显示，红球菌z13与菌株rhodococcus zopfii(jcm 9919)和rhodococcus phenolicus(dsm 44812)相似性最高为(均为98.62％)。使用n-j法构建进化树，结果显示，红球菌z13菌株与菌株rhodococcus zopfii(jcm 9919)和rhodococcus phenolicus(dsm 44812)聚成一枝，与rhodococcus属的菌聚成一簇，结合16s rrna基因序列比对结果可知，红球菌z13菌株是rhodococcus属的一株菌。红球菌z13菌株的16s rdna的核苷酸序列如序列表所示，长1521bp。
8.进一步说明，所述的红球菌(rhodococcus sp.)z13的生物学特征为：在lb平板上的形态为粉红色，圆形有凸起，湿润，边缘整齐，直径约为2mm；细胞为短杆状，细胞大小为
(0.75～1.05)
×
(1.2～1.5)μm。
9.进一步说明，所述的红球菌(rhodococcus sp.)z13的生理生化特征为：吐温20实验结果为阴性，氧化酶、淀粉酶、纤维素水解、硝酸盐还原、牛奶凝固与胨化、色氨酸分解、硫化氢产生、mr实验、v-p实验为阴性，过氧化氢酶、脲酶、吐温40、吐温80、明胶液化为阳性。
10.本发明还提供一种红球菌z13菌株的培养方法，将上述所述红球菌z13菌株活化后，接种到ph条件为7.0-8.0、温度为37-40℃、nacl的质量浓度为0-1％的培养基中培养。
11.本发明还提供如上所述红球菌z13菌株在处理苯酚类废水中的应用。
12.本发明还提供一种包含如上所述的红球菌z13菌株的菌剂。
13.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
14.利用本发明提供的红球菌(rhodococcus sp.)z13菌株经过鉴定红球菌z13菌株是rhodococcus属的一株新种，命名为：rhodococcus ferula。且该菌株具有耐高温的特性，且最高可耐受45℃依旧可以正常生长。该菌株的最适ph条件为7.0-8.0、最适的温度为37-40℃、z13的nacl的质量浓度为0-1％。通过实验证明在45℃高温条件下，红球菌z13能在30h内将浓度为1300mg/l的苯酚完全降解；可见，本发明筛选出来的菌株在酚类废水的生物处理上具有高效性，有广阔的应用前景。
【附图说明】
15.图1：红球菌z13菌株在电镜下细胞形态图。
16.图2：红球菌z13菌株在不同t条件下的生长情况图。
17.图3：红球菌z13菌株在不同ph值条件下的生长情况图。
18.图4：红球菌z13菌株在不同nacl条件下的生长情况图。
19.图5：红球菌z13菌株的极性脂图。
20.图6：红球菌z13菌株、jcm 9919、dsm 44812呼吸醌hplc峰图。
21.图7：红球菌z13菌株及其亲缘相近菌株的16s rdna序列进化树图。
22.图8：45℃条件下菌株z13对不同初始浓度苯酚的降解对比图。
23.图9：45℃条件下菌株z13对不同初始浓度苯酚的od值对比图。
【具体实施方式】
24.本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
25.本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
26.实施例1：红球菌z13菌株的筛选、鉴定
27.1、菌株的筛选
28.土壤样品采集自广西柳州市三江县。称取1g土壤样品加入装有100ml以碱性木质素为唯一碳源的摇瓶中，37℃、200rpm摇床富集48h。将富集液用无菌水作10倍梯度稀释，取100μl 10-1-10-7倍数稀释液分别涂布到以碱性木质素为唯一碳源的培养基上30℃生化培培养2d。观察生长状况与形态特征，将长出的单菌落多次划线纯化，再挑取单菌落转接至lb斜面培养基，置4℃作保藏备用。
29.2、菌株的生理生化特征
30.(1)形态特征
31.挑取z13单菌落于lb固体平板上划线，37℃培养24h。结果显示：z13在lb平板上的形态为粉红色，圆形有凸起，湿润，边缘整齐，直径约为2mm。
32.lb培养基配方：胰蛋白胨(tryptone)10g，酵母提取物(yeast extract)5g，氯化钠(nacl)10g，固体培养基另加琼脂粉20g，加双蒸水至1000ml，ph值7.2。
33.取10-20ml菌液，10000rpm、4℃离心5min收集菌体，用pbs缓冲液洗涤3次，每次静置10min，菌体中加入2.5％戊二醛1ml重悬菌体，4℃静置过夜。固定完成后，10000rpm、4℃离心5min，收集菌体，用浓度梯度为20％、40％、60％、80％、100％的乙醇溶液依次重悬菌体，每个浓度处理10min，10000rpm离心5min。-80℃预冷菌体后使用真空冷冻干燥机将菌体干燥成粉末，干燥后喷金，使用扫描电子显微镜观察细胞的形态(图1)。结果显示：红球菌z13菌株的细胞为短杆状，细胞大小为(0.75-1.05)
×
(1.2-1.5)μm。
34.(2)生长特征
35.不同温度对红球菌z13菌株生长的影响实验，配置lb液体培养基，将菌液接种于摇瓶中，分别于20、25、28、30、35、37、42、45和50℃摇床培养，200rpm震荡培养24h。使用紫外分光光度计在600nm下检测其吸光值。如图2结果显示：z13的温度生长范围是28-45℃，最适温度是37-40℃。
36.不同ph对红球菌z13菌株生长的影响实验，配制lb液体培养基，分别调节ph为4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11，将新鲜菌液接入摇瓶，200rpm、37℃摇床培养24h。使用紫外分光光度计在600nm下检测其吸光值。如图3结果显示：z13的ph生长范围是5.5-9.0，最适ph为7.0-8.0。
37.不同nacl浓度对红球菌z13菌株生长的影响实验，配制lb液体培养基，分别调节nacl浓度为0、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、8％、10％和15％，将新鲜菌液接入摇瓶，200rpm、37℃摇床培养24h。使用紫外分光光度计在600nm下检测其吸光值。如图4结果显示：z13的nacl浓度范围是0-8％，最适浓度为0-1％。
38.(3)生理生化特征
39.红球菌z13菌株的生理生化特征实验具体方法参考《常见细菌系统鉴定手册》和《放线菌系统学——原理、方法及实践》。如表1的结果显示：红球菌z13菌株吐温20实验结果为阴性，而参比菌株jcm 9919、dsm 44812吐温20实验结果为阳性不一致，氧化酶、淀粉酶、纤维素水解、硝酸盐还原、牛奶凝固与胨化、色氨酸分解、硫化氢产生、mr实验、v-p实验红球菌z13菌株与参比菌株结果一致全为阴性，过氧化氢酶、脲酶、吐温40、吐温80、明胶液化红球菌z13菌株与参比菌株一致都为阳性。
40.表1红球菌z13菌株及其参比模式菌株的生理生化特征
[0041][0042]
3、化学组分分析
[0043]
(1)极性脂
[0044]
极性脂提取：8000rpm离心10min收集菌体，用蒸馏水洗2-3次。称取1g湿菌体于一带螺口的50ml离心管中，加入15ml甲醇100℃水浴5min，自然冷却。然后加入10ml氯仿再加入2％nacl，直至明显分层，用力摇匀10min，8000rpm离心10min。离心后垂直静置离心管，待分层后取下层无杂质的液体，使用氮吹仪浓缩吹干，分两次各加入200μl氯仿/甲醇(2:1，v/v)振荡混匀，将液体移入1.5ml离心管，8000rpm离心10min，去沉淀。4℃保存备用。
[0045]
双向薄层层析及显色：用毛细管移取5
–
15μl极性脂抽提液点样于10
×
10cm硅胶h板(距底边1.5
×
1.5cm处上样)；双向展层(垂直的两个方向)，先以氯仿/甲醇/水溶液(65:25:4，v/v，色谱纯)为第一相展层剂，展层至距顶边1.5cm处取板，自然风干；再以氯仿/冰醋酸/甲醇/水溶液(80:18:12:5，v/v，色谱纯)为第二相展层剂，展层至距顶边1.5cm处取板，自然风干。层析完毕后喷洒不同的显色剂进行显色观察，并与参比模式菌进行对照，以确定待测菌株的极性脂类型。如图5所示结果显示：红球菌z13菌株主要含有dpg、pe、pg、pi、pim、gl、gpl和一些未知脂类。
[0046]
(2)呼吸醌
[0047]
提取及纯化：取100mg冻干菌体，加入40ml氯仿/甲醇溶液(2:1，v/v)，用报纸包裹避光，摇床震荡过夜约10h；滤纸过滤后收集滤液，用氮吹仪吹干，加入1ml相同的氯仿/甲醇溶液重新溶解；于10
×
20cm gf254硅胶板上长条状点样(距底边1.5cm处上样)，以甲苯溶液(分析纯)为展层剂，展层至距顶边1.5cm处取板，自然风干，置于254nm的紫外灯下观察，位于硅胶板的较上部，迁移率rf值为0.8附近，呈暗褐色的条带为甲基萘醌(mk)的位置，而迁移率rf值为0.5左右，呈暗褐色的条带则为泛醌(q)的位置；刮下含有目的条带的硅胶，重溶于1ml丙酮中，膜过滤后收集滤液，低温避光保存。
[0048]
高效液相色谱分析：使用agilent 1260infinity ii高效液相色谱仪(hplc)和agilent 5hc-c18反相柱(4.6
×
250mm)检测。流动相为甲醇/异丙醇溶液(2:1，v/v；色谱纯)，流速设为1ml/min，柱温为40℃，紫外检测波长为250nm和270nm。参比模式菌的呼吸醌提取物为标准品。
[0049]
如图6实验结果：红球菌z13菌株呼吸醌为mk-8(h2)，与参比菌株一致。
[0050]
4、基因型比对
[0051]
(1)16s rrna基因序列比对
[0052]
提取红球菌z13菌株的基因组dna，使用通用引物27f和1492r进行pcr扩增，测序，得到的16s rrna基因序列(seq id no:1)提交到ezbiocloud比对。结果显示，红球菌z13菌株与菌株rhodococcus zopfii(jcm 9919)和rhodococcus phenolicus(dsm 44812)相似性最高为(均为98.62％)。
[0053]
(2)系统进化树分析
[0054]
使用n-j法构建进化树，结果显示，红球菌z13菌株与菌株rhodococcus zopfii(jcm 9919)和rhodococcus phenolicus(dsm 44812)聚成一枝，与rhodococcus属的菌聚成一簇，结合16s rrna基因序列比对如图7结果可知，红球菌z13菌株是rhodococcus属的一株菌。
[0055]
(3)ani和dddh分析
[0056]
对红球菌z13菌株和相近的模式菌株rhodococcus zopfii(jcm 9919)和rhodococcus phenolicus(dsm 44812)进行ani和dddh分析，参考表2的结果显示：红球菌z13菌株与rhodococcus zopfii(jcm 9919)和rhodococcus phenolicus(dsm 44812)的ani和dddh值均低于种间界限临界值(ani为95-96％，dddh为70％)，由此可知，红球菌z13菌株与参比菌株的基因组存在明显差异。
[0057]
表2.红球菌z13菌株与参比菌株的ani、dddh的计算结果，上行为dddn、下行为ani
[0058][0059]
结合菌株的生理生化、化学特征和基因型分析，红球菌z13菌株和rhodococcus属的模式菌株有很多相似的特征，但也具有很多差异，由此可知，红球菌z13菌株是rhodococcus属的一株新种，命名为：rhodococcus ferula。
[0060]
鉴定得到的红球菌z13菌株，已经在2022年10月13日保藏在广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为gdmcc no.62880，保藏地址为：中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0061]
实施例2：红球菌(rhodococcus ferula)z13菌株对苯酚的降解能力
[0062]
将菌种红球菌(rhodococcus ferula)z13接至无机盐培养基(nacl 5g，nh4no
3 1g，mgso4·
7h2o 0.2g，kh2po
4 0.5g，k2hpo
4 0.5g，1000ml去离子水。)中，调节ph至8.0，分别加
入不同初始浓度300、500、800、1000、1200和1300mg/l的苯酚，45℃、200rpm培养，取样检测苯酚含量。每6h取样检测菌体生长状况及残余苯酚含量。菌体生长状况检测方法：取样，用紫外分光光度计测菌悬液在600nm时的吸光度。残余苯酚含量检测方法：取样，12000rpm离心5min，过0.22μm尼龙滤膜，样品使用hplc检测；实验重复三次，结果取平均值。如图8、图9结果显示，在高温条件下，红球菌(rhodococcus ferula)z13能在30h内将浓度为1300mg/l的苯酚完全降解。
[0063]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。