用于鉴别禽白血病病毒A或/和J亚群的引物对及试剂盒

id no.5所示。
9.优选地，所述引物对的目标基因为禽白血病病毒基因组的env基因中gp85基因。
10.本发明目的之二在于提供上述引物对在制备鉴别禽白血病病毒a亚群或/和j亚群产品中的应用。
11.优选地，产品为药品、试剂或试剂盒。
12.本发明目的之三在于提供一种鉴别禽白血病病毒a亚群或/和j亚群的试剂盒，包括：上述引物对。
13.优选地，还包括：用于鉴别禽白血病病毒a亚群或/和j亚群的探针。
14.用于鉴别禽白血病病毒a亚群的探针为tq-alv-a-probe，用于鉴别禽白血病病毒j亚群的探针为tq-alv-j-probe；tq-alv-a-probe和tq-alv-j-probe均由核酸序列、接枝在核酸序列5’端的荧光报告基团和接枝在核酸序列3’端的荧光淬灭基团组成。
15.优选地，tq-alv-a-probe的核酸序列如seq id no.3所示，tq-alv-j-probe的核酸序列如seq id no.6所示。
16.优选地，tq-alv-a-probe的荧光报告基团为6-羧基荧光素(fam)基团，tq-alv-j-probe的荧光报告基团为6-羧基荧光素(vic)基团，而tq-alv-a-probe和tq-alv-j-probe的荧光淬灭基团均为bhq-1羧酸(bhq1)基团。
17.优选地，引物浓度均为10μmol/l，探针浓度均为20μmol/l。
18.本发明目的之四在于提供一种鉴别禽白血病病毒a亚群或/和j亚群的方法，包括如下步骤：
19.(1)提取待测样品的dna作为模板；
20.(2)采用上述试剂盒对模板dna进行快速rpa扩增及荧光探针检测。
21.本技术所用双重荧光探针法特异性和重复性极强，灵敏度极高，当病毒样本含量高于40拷贝/μl即可检测出来，而且可以同时准确的检测出样品中的病毒种类和载毒量，与标准化的荧光定量pcr的符合度达到100％，为探究鸡场alv的流行情况和快速净化提供技术支撑。
附图说明
22.图1为阳性质粒标准品(pmd18a和pmd18j)、4型禽腺病毒(fadv-4)的dna、鸡马立克病毒(mdv)、h5和h9禽流感(aiv5/9)、禽网状内皮组织增生病病毒(rev)和法氏囊病毒(ibv)的特异性试验扩增曲线；其中两条上扬曲线中，实线为pmd18a的特异性试验扩增曲线，虚线为pmd18j的特异性试验扩增曲线。
23.图2为采用本发明双重荧光探针法对alv-j的敏感度检验曲线。
24.图3为采用本发明双重荧光探针法对alv-a的敏感度检验曲线。
25.图4为采用本发明双重荧光探针法对收集所得24份阳性种鸡的精液样品的检测结果；其中虚线为alv-j扩增曲线，实线为alv-a扩增曲线。
具体实施方式
26.下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
27.实施例1设计与合成双重荧光探针
28.使用dna star 7.1引物分析软件和oligo 7.0引物设计软件，根据genbank登录的alv-a和alv-j亚群的部分毒株的gp85基因片段，设计亚群特异性引物tq-alv-a-f、tq-alv-a-r和探针tq-alv-a-probe(登录号dq412726)，tq-alv-j-f、tq-alv-j-r和探针tq-alv-j-probe(登录号kf218957)。
29.引物及探针序列如下：
[0030][0031][0032]
上述引物和探针由上海生工生物工程有限公司合成，引物浓度均为10μmol/l，探针浓度均为20μmol/l。
[0033]
实施例2分离病毒并制备标准质粒
[0034]
取1g alv阳性鸡肝脏用剪刀剪碎，研磨后加入无菌生理盐水制成病毒悬液，反复冻融后离心，上清经0.22μm过滤器滤过后接种到密度为80％的df-1细胞中，在37℃、5％ co2条件下孵育2h，弃去培养基，换成含2％胎牛血清的dmem维持培养基，持续培养7d，期间换液一次，收集细胞培养液。
[0035]
使用trizol法提取病毒rna，通过反转录试剂盒反转录为cdna。pcr分别扩增alv-pol、alv-j、alv-a基因片段。反应体系如下：10μl 2
×
fast taq premix、1μl上游产物(10μmol/l)、1μl下游产物(10μmol/l)、1μl cdna，无菌去离子水补齐至20μl。pcr产物进行纯化回收。所得dna片段分别连接pmd-18t载体后，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，37℃培养18h，菌落pcr筛选阳性克隆由上海生工生物公司进行测序鉴定。分别命名为pmd18a、pmd18j和pmd18pol，使用分光光度仪测定浓度，-20℃保存作为标准品备用，根据公式：拷贝数(拷贝/μl)＝[6.02
×
10
23
(拷贝/mol)
×
浓度(ng/μl)
×
10-9
]/[660
×
碱基数(g/mol)]，将质粒浓度分别换算成拷贝数。
[0036]
重组质粒pmd18a和pmd18j的初始浓度分别为80ng/μl和181ng/μl，计算获得的拷贝数分别为2.15
×
10
10
拷贝/μl和5.11
×
10
10
拷贝/μl。
[0037]
实施例3优化a/j亚群双重荧光探针方法
[0038]
使用iiprobeqpcrsupermixudg试剂盒，采用正交试验法，对引物用量(0.2-0.8μl)、探针用量(0.2-0.8μl)和退火温度(55-65℃)进行优化，获得最佳反应体系和条件。
[0039]
以上述浓度为2.15
×
105拷贝/μl和5.11
×
105拷贝/μl的质粒为模板进行反应体系优化，当引物和探针在反应体系中的浓度分别为1μmol/l和2μmol/l时，ct值最小，扩增效率稳定。
[0040]
反应体系(总计20μl)为：ii probe qpcr supermix 10μl，上
下游引物(10μmol/l)各0.2μl，探针(10μmol/l)0.2μl，模板1μl，ddh2o 8.6μl。反应程序为：94℃5min，94℃5s，61℃35s，42个循环扩增效果最佳。
[0041]
实施例4建立双重荧光探针方法标准曲线
[0042]
上述重组质粒pmd18a和pmd18j在拷贝2.0
×
101～2.0
×
108拷贝/μl时，范围内线性关系良好。
[0043]
alv-a方程为：y＝-3.3280logx+40.95；alv-j方程为：y＝-3.3195logx+42.41，扩增效率均为100％；相关系数(r2)均为1.00。
[0044]
实施例5验证双重荧光探针方法特异性
[0045]
以质粒标准品为对照，空载体为阴性对照，采用4型禽腺病毒(fadv-4)的dna、鸡马立克病毒(mdv)、h5和h9禽流感(aiv5/9)、禽网状内皮组织增生病病毒(rev)和法氏囊病毒(ibv)的cdna为模板，利用本技术建立的方法分别检测。
[0046]
如图1所示，只有alv-a和alv-j呈现特异性扩增曲线，其他病原及其阴性对照无扩增。
[0047]
实施例6验证双重荧光探针方法敏感性
[0048]
以稀释浓度梯度混合标准质粒作为模板，用获得的最佳反应体系和条件进行双重荧光定量探针pcr扩增，通过软件分析能正常扩增的最低拷贝数。
[0049]
应用所建立的双重荧光定量探针pcr方法，将两种经稀释后的标准品质粒等比例混合后作为模板检验该方法的敏感度。如图2和图3显示，两种亚群在模板拷贝数为4.0
×
101拷贝/μl时仍可扩增出圆滑曲线，alv-a/j可检测的最低拷贝数为40拷贝/μl。
[0050]
实施例7验证双重荧光探针方法稳定性
[0051]
用获得的最佳反应体系及条件，选取浓度为2.0
×
108拷贝/μl、2.0
×
106拷贝/μl和2.0
×
104拷贝/μl的混合阳性质粒作为模板，进行双重荧光定量探针pcr扩增，每个浓度重复扩增3次，根据3次扩增的ct值分别计算变异系数，根据变异系数评价双重荧光定量探针pcr的稳定性。
[0052]
两种阳性标准质粒等比例混合后做1：10稀释，分别挑选2.0
×
108拷贝/μl、2.0
×
106拷贝/μl和2.0
×
104拷贝/μl三个浓度梯度作为模板进行双重荧光定量探针pcr扩增，每个浓度梯度重复扩增3次，根据3次扩增的ct值分别计算组内变异系数。结果如下表所示。
[0053][0054]
上表显示：两种亚群的三个浓度梯度的变异系数均小于1.00％，证明建立的双重荧光定量探针pcr方法的稳定性较强，重复性较好。
[0055]
实施例8临床验证双重荧光探针方法
[0056]
筛选从安徽省某县4个养殖场收集到24份阳性种鸡的精液样品作为本发明双重荧光探针法的检测样品。
[0057]
用常规trizor法提取种鸡场获得24份alv阳性精液样品的rna并反转录成cdna，使用建立的双重荧光定量探针法进行检测。
[0058]
使用建立好的双重荧光定量探针pcr方法对上述24份精液样品进行检验。如图4所示，采用本发明方法检测的alv阳性率为100％，其中alv-j为18份，占75％；alv-a 6份，占25％，经过与标准禽白血病诊断技术(gb/t 26436-2010)检测相比，符合率为100％。具体结果如下：
[0059][0060]
在已知的11个alv的亚群中，感染鸡的主要为j亚群、其次是a亚群。但是由于病毒的不断重组和引发的严重免疫抑制现象，导致其给养禽业带来严重危害。虽然不断淘汰，但是依然持续存在，目前，尽早检测并淘汰是最理想的方法。检测alv的方法有常规pcr、荧光定量pcr(qpcr)、免疫荧光检测(ifa)、环介导等温扩增(lamp)、逆转录重组酶辅助扩增实验(rt-raa)、重组酶聚合酶扩增实验(rpa)、实时荧光定量重组酶聚合酶扩增实验(rpa)、胶体金法、elisa和夹心elisa法(selisa)等。
[0061]
由于lamp需要在水浴或者培养箱进行，且容易出现假阳性，在临床应用有限，故临床最常用的方法主要有elisa、pcr和qpcr。而elisa方法需要辅助，只能检测抗体且不能区分亚群且存在一定的假阳性。间接免疫荧光试验(ifa)是禽白血病检测的“金标准”，但操作复杂且要求实验人员具有一定的经验，所以通常只作为一种辅助检测的方法。因此检测alv核酸最主要的方法是pcr和qpcr，临床也根据养殖场的要求选择不同的检测方式。相对来说，pcr成本较低，适用于大批量的筛选，而qpcr的成本较高但是准确度也极高，适合于种鸡场，尤其是精液的检测和病毒在体内的载量分析。
[0062]
本技术所用双重荧光探针法灵敏度高，病毒样本含量高于40拷贝即可同时检测j亚群和a亚群。经对临床24份精液样品验证，结果显示可以同时准确的检测出样品中的病毒种类和载毒量，其灵敏度与现有的单重荧光探针法相比，阳性符合率达到100％。本发明为探究鸡场alv的流行情况和快速净化建立了方法，提供了技术支撑。
[0063]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。