一种通过高通量靶向测序实现猪15种病原同时检测的引物组及应用

本发明涉及靶标基因检测的高通量，尤其涉及一种通过高通量靶向测序实现猪15种病原同时检测的引物组及应用。

背景技术：

1、扩增子测序是一种高靶向性方法，通过对靶标基因保守区域附近设计引物，进行pcr扩增并进一步对扩增产物进行测序分析，其总体思路是靶向地捕获目标区域，然后进行新一代测序(ngs)，分析测序结果，从而得到相应信息。

2、扩增子测序主要包括16srdna测序、18srdna测序、its测序及目标区域扩增子测序等。目前主要多将其应用于宏基因组学样本的分析，采用第二代高通量测序平台测定的16s/18s/its某个高变区域的序列，来反应环境样品在细菌、真菌、古菌分类方面物种之间的差异，从而研究海洋、土壤、肠道粪便等环境中的微生物构成；此外也有少数研究将扩增子测序应用于病原检测，但目前尚未有针对猪呼吸道病原检测的相关设计。

3、猪的呼吸道疾病主要由病毒、细菌和其他病原单独或混合感染引起，而病原的诊断方法通常为核酸检测、抗原检测等，一般来说每种检测手段大多都是单一的针对某种病原，尚不能实现多种病原同时快速、精准诊断。此外当今猪场疫病检测用的最广泛的荧光定量检测手段最多只能检测3～5种病原，但也只是简单的进行病原基因的诊断，而不能在疾病诊断的基础上进一步检测出病原基因突变，从而发现新的变异病原。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种通过高通量靶向测序实现猪15种病原同时检测的引物组，用于针对 15种猪呼吸道病原的42种靶标基因扩增子测序检测分析方法，具有快速、高效、高靶向、特异性强等技术优点，适用于猪场患病猪的病原快速、准确与多病原同时诊断。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种通过高通量靶向测序实现猪15种病原同时检测的引物组，包括核苷酸序列如 seq id no.1～seq id no.302所示的引物；所述引物组用于扩增病原靶标基因；所述病原靶标基因如下：

4、

5、

6、；所述病原靶标基因核苷酸序列如seq id no.303～seq id no.344所示；

7、seq id no.303:atggcatcaggaggagctttttgtcttattgctaacgatgggaaggccgacaagattatattggcccaagacttgctgaatagca ggatctctaacattaaaaatgtgaacaaaagttatgggaaacccgatcccgaacccactttgagtcaaatcgaagaaacacatttggtgcattttaatgcgcattttaagccttatgttccagtagggtttgaatacaataaagtacgcccgcatacgggtacccccaccttgggaaacaagcttacctttggtattccccagtacggaga ctttttccatgatatggtgggccatcatatattgggtgcatgtcattcatcctggcaggatgctccgattcagggcacgtcccagatgggggcccatgggcagcttcaaacgtttcctcgcaacggatatgactgggacaaccaaacacccttagagggcgccgtttacacgcttgtagatccttttggaagacccattgtacccggca caaagaatgcgtaccgaaacttggtttactactgcgaataccccggagaacgactttatgaaaacgtaagattcgatgtaaatggaaattccctagacgaatatagttcggatgtcacaacgcttgtgcgcaaattttgcatcccaggggataaaatgactggatataagcacttggttggccaggaggtatcggtggagggaaccag tggccctctcctatgcaacattcatgatttgcacaagccgcaccaaagcaaacctattcttaccgatgaaaatgatacgcagcgaacgtgtagccataccaacccgaaatttctttcacagcattttcccgagaactctcacaatatccaaacagcaggtaaacaagatattactcctatcacggacgcaacgtatctggacataagac gtaatgttcattacagctgtaatggacctcaaacccctaaatactatcagccccctcttgcgctctggattaagttgcgcttttggtttaatgagaacgtgaaccttgctattccctcagtatccattcccttcggcgagcgctttatcaccataaagcttgcatcgcaaaaggatttggtgaatgaatttcctggactttttgtacgccagtcac gttttatagctggacgccccagtagacgcaatatacgctttaaaccatggtttatcccaggagtcattaatgaaatctcgctcacgaataatgaactttacatcaataacctgtttgtaacccctgaaatacacaacctttttgtaaaacgcgttcgcttttcgctgatacgtgtccataaaacgcaggtgacccacaccaacaataaccacc acgatgaaaaactaatgtctgctcttaaatggcccattgaatatatgtttataggattaaaacctacctggaacatctccgatcaaaatcctcatcaacaccgagattggcacaagttcggacatgttgttaacgccattatgcagcccactcaccacgcagagataagctttcaggatagagatacagctcttccagacgcatgttcatct atatctgatattagccccgttacgtatccgatcacattacctattattaaaaacatttccgtaactgctcatggtatcaatcttatcgataaatttccatcaaagttctgcagctcttacatacccttccactacggaggcaatgcgattaaaacccccgatgatccgggtgcgatgatgattacctttgctttgaagccacgggaggaatacca acccagtggtcatattaacgtatccagagcaagagaattttatattagttgggacacggattacgtggggtctatcactacggctgatcttgtggtatcggcatctgctattaactttcttcttcttcagaacggttcagctgtgctgcgttacagtacctaa；

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37、seq id no.333:atgacaaaattaactatgcaagatgtgaccaatttatatttatataaaacgaaaactctacctaaagatagattggatgattcac ttatttctgaaataggaaaaggagatgatgatattgatagaaaagaatttatggtggggccgggacgttttgtgaccgctgataactttagcgttgtaagagatttttttaatgctgggaaatcacgcattattgcgccgcaagtcccgcctattcgttcacagcaggaaaaaatcttggtcggtttaaaaccgggcaaatattccaaagcg cagatattggaaatgctgggttatacgaaaggcggagaagtggtaaatggcatgtttgccggtgaagtccagacattaggcttttatgacgatggcaaaggggatttactcgaacgcgcctatatctggaataccacaggatttaaaatgagcgacaatgccttttttgttatagaagaatcaggcaaacgctatattgaaaactttggtattgaacctcttggtaagcaagaagattttgattttgtcggcggcttttggtctaacttagtgaatcgtggtttggaaagtattatcgacccatccggtatcggtggaacggtaaaccttaactttaccggcgaggtggaaacctacacgttagacgaaacaaggtttaaagcggaagcggcgaagaaaagccattggagtttagtgaat gcggcgaaagtatacggcggtttagaccaaattattaaaaaactatgggacagtggctcaattaagcatttatatcaagataaagatacgggcaaattaaaaccgattatttacggcacggccggcaacgacagtaagattgaaggcactaaaatcacccgtaggattgcgggtaaagaagttacgcttgatattgccaatcagaaa attgaaaaaggcgtgttagagaaattggggctgtctgttagtggttcggatatcattaaattgttgtttggagcattgactccaactttaaatagaatgttgctatcacaacttatccagtctttttccgatagcttggctaaacttgataatcccttagccccttacactaaaaatggcgtggtttatgtcaccggcaaagggaatgatgtgctta aaggaactgaacatgaggatttgtttctcggtggtgaggggaatgatacttattatgcgagagtaggcgatacaattgaagacgccgacggcaaaggtaaagtctattttgtgagagaaaaaggggtacctaaggcggatcctaagcgggtagagtttagcgagtacataacgaaagaagaaataaaagaggttgaaaaggggtt attaacttacgcagttttagaaaattataattgggaagagaaaacggcgactttcgctcatgcgactatgcttaatgagctttttactgattatactaattatcgttatgaagttaaaggactaaaattgcccgccgttaaaaagttaaaaagtccgttggtggagtttacagctgatttattaactgttacgcctattgacgaaaacggaaaagc acttagcgaaaaaagtattacggttaaaaattttaaaaatggtgatttaggaataaggttgttggatcctaatagctattattatttccttgaaggccaagatacgggtttttatggtcctgctttttatattgaacgaaaaaacggtggcggcgctaaaaataactcgtcgggagcaggaaatagcaaagattggggcgggaacgggcatg gaaatcaccgaaataatgcctccgacctgaataaaccggacggaaataatgggaataaccaaaataacggaagcaatcaagataatcatagcgatgtgaatgcgccaaataacccgggacgtaactatgatatttacgatcctttagctttagatttagatggagatgggcttgaaaccgtgtcgatgaacgggcgacaaggcgcg ttattcgatcatgaaggaaaaggtattcgtaccgcaacgggctggctcgctgcggatgacggttttttagtgttagatcgtaaccaagacggcattattaatgatataagcgagttatttagtaataaaaatcaactttccgacggcagtatttctgcacacggttttgcgacattagccgatttggatacaaaccaagatcagcgtatcgac caaaatgataagctgttttctaaactccaaatttggcgggatttaaatcaaaacggttttagtgaagcgaatgagctgtttagcttagaaagtttgaatattaaatctttacataccgcctatgaagagcgtaatgattttctagcgggcaataatatccttgctcagcttgggaagtatgaaaaaacggacggtacttttgcacaaatgggcg atttaaatttcagttttaacccgttttatagccgatttaccgaagcgttaaatttaaccgagcaacaacgtcgcacaattaatctaaccggcaccggtcgggttcgggatttgcgtgaagccgccgcactttctgaggagttggctgctttattacaacagtacactaaggcctccgattttcaggcacaacgagaattattgcctgccatttt agataaatgggcggcaacggatttacagtatcaacattatgataaaacattacttaaaacggtagaaagtaccgatagtagtgcttctgtcgttagagtcacgccttctcaattaagtagtatacgcaatgcaaagcatgatcctaccgttatgcaaaactttgaacagagtaaggcaaaaattgcgactttaaattcgctctacgggttaa atatcgatcaactttattacacgacggataaagacattcgctatattactgataaagtgaataatatgtatcaaacaaccgtagaacttgcctaccgttctttacttttacaaacgcgtttgaagaaatatgtttatagcgttaatgcgaaacaattcgaagggaaatgggtaaccgattattctcgtactgaagccttatttaactctacttttaaa caatcgcctgaaaatgcattatatgatttaagcgaatacctttctttctttaacgatcctacggaatggaaagaagggctattactgttaagccgttatatagattatgctaaagcacaaggattttatgaaaactgggcggctacttctaacttaactattgcccgtttaagagaggctggagtaatttttgcagaatcgacggatttaaaagg cgatgaaaaaaataatattttgttaggtagccaaaaagataataacttatcgggtagtgcaggtgatgatctacttatcggcggagagggtaatgatacgttaaaaggcagctacggtgcagacacctatatctttagcaaaggacacggacaggatatcgtttatgaagataccaataatgataaccgcgcaagagatatcgacaccttaaaatttaccgatgtgaattatgcggaagtgaagtttcgacgagtagataatgacttaatgttattcggttatcatgatacggattcggtcacggtaaaatccttct acagccatgtagattatcaatttgacaaattggagtttgctgaccgcagtataactcgcgatgaactgattaaagcagggcttcatctatacggcaccgatggcaatgatgatataaaggatcatgcggattgggacagcattttggaaggcggcaaaggcaacgatattctaagaggtggctacggtgcggacacctatatctttag caaaggacacggacaggatatcgtttatgaagataccaataatgataaccgcgcaagagatatcgacaccttaaaatttactgatgtgaattatgcggaagtgaaattccgacgagtagataatgacttaatgttattcggttatcatgatacggattcggtcacgataaaatccttctacaaccatgtagattatcaatttgacaaattgga atttgctgaccgcagtataactcgtgatgaactaggtaaacaaggtatggcattatttggcactgacggtgatgataatatcaacgactggggacgtaactcggt gattgatgccggtgcgggtaatgatacggttaatggcggtaatggcgatgacaccctcatcggcggcaaaggtaatgatattctaagaggtggctacggtgcggacacctatatctttagcaaaggacacggacaggatatcgtttatgaagataccaataatgataaccgcgcaagagatatcgacaccttaaaatttaccgatgt gaattatgcggaagtgaaattccgacgagtagataatgacttaatgttattcggttatcatgatacggattcggtcacggtaaaatccttctacagccatgtagattatcaatttgacaaattggagtttgctgaccgcagtataactcgcgatgaactgattaaagcagggcttcatctatacggcaccgatggcaatgatgatataaagg atcatgcggattgggacagcattttggaaggcggcaaaggcaacgatattctaagaggtggctacggtgcggacacctatatctttagcaaaggacacggacaggatatcgtttatgaagataccaataatgataaccgagcaagagatatcgacaccttaaaatttactgatgtgaattatgcggaagtgaaattccgacgagtag ataatgacttaatgttattcggttatcatgatacggattcggtcacgataaaatccttctacaaccatgtagattatcaatttgacaaattggaatttgctgaccgcagtataactcgtgatgaactaggtaaacaaggtatggcattatttggcactgacggtgatgataatatcaacgactggggacgtaactcggtgattgatgccggtgc gggtaatgata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45、seq id no.341:ttgctcaaaaaatttaaaaattttattctattttcatctatattttcaccaatagcatttgctatatcatgttctaatacaggagtagtc aagcaagaggatgtatcagttagtcaaggtcaatgagataaaagtataacatttggtgtttcagaagcttggttaaacaagaaaaaaggagataaagaagttaacaaagaagttattaatacatttttagaaaatttcaaaaaagaatttaataaactcaaaaatgcaaatgataaaaccaaaaacttcgatgacgttgattttaaagtaact ccaattcaagactctactgtgttgttaaacaatttatctactgacaatcctgaattagattttggaattaatgcttcaggaaaattggtagaatttctaaaaaataatcctggtataataactcctgcattagaaacaacaactaattcttttgtatttgacaaagaaaaagataaattttatgttgatggtacagattcagatccacttgtaaaaattg ctaaagaaattaataaaatttttgttgaaactccatatgcaagttgaactgatgaaaatcataagtgaaatggtaatgtttatcaaagtgtttacgatccaactgttcaagctaatttttatagaggaatgatttgaataaaaggtaatgatgaaactctagctaaaattaaaaaagcttgaaatgataaagattgaaatacatttagaaattttgg aattttacacggtaaagataattcttcttctaaattcaagttagaagaaactatattaaaaaaccactttcaaaataaatttacaacactaaatgaagacagaagcgcacatccaaacgcatataaacaaaaatctgcagatacattgggaactttagatgatttccatattgctttttcagaagaaggttcttttgcttgaacacataacaaatc agcaacaaaaccttttgaaactaaagcaaatgaaaagatggaagcacttatagtaactaatccaattccgtatgatgttggagtgtttagaaaaagtgttaaccaattagaacaaaatttaattgttcaaacattcattaatttagctaaaaataaacaagatacatatggtccacttttagggtataatggttataaaaaaattgacaatttcca aaaagagattgtagaagtttatgaaaaagccattaaataa；

46、seq id no.342:gatgaacgctcgctgtgtgcctaatacatgcatgttgaacgggatgtagcaatacattcagtagcgaatgggtgagtaaca cgtacctaacctacctttaagactgggataactattggaaacaatagctaataccggatatagttatttatcgcatgatgagtaatagaaaggagcttcacagcttcacttaaaaatgggggtgcggaacattagttagttggtagggtaatggcctaccaagacgatgatgtttagccgggccgagaggctgtacggccacactggga ctgagatacggcccagactcctacgggaggcagcagtaaggaattttccacaatgagcgaaagcttgatggagcgacacagcgtgcaggatgaagttcttcggaatgtaaactgctgttataagggaagaaaaaatagaataggaaatgattttatcttgacggtaccttattagaaagcgacggcaaactatgtgccagcagcc gcggtaatacataggtcgcgagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgtccgtaggttttttgctaagtctggagttaaatgctgaagctcaacttcagtccgctttggatactggcaaaatagaattataaagaggttagcggaattcctagtgaagcggtggaatgcgtagatattaggaagaacaccaataggcgaaggcag ctaactggttatatattgacactaagggacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgatcattagttggtggaataatttcactaacgcagctaacgcgttaaatgatccgcctgagtagtatgctcgcaagagtgaaacttaaaggaattgacgggaacccgcacaagcggtgga gcatgtggtttaatttgaagatacgcgtagaaccttacccactcttgacatcttctgcaaagctatagagatatagtggaggttaacagaatgacagatggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttaggttaagtcctgcaacgagcgcaacccttttctttagttactaatattaagttaaggactctagagatactgcctgg gtaaccaggaggaaggtggggacgacgtcaaatcatcatgcctcttacgagtggggcaacacacgtgctacaatggtcggtacaaagagaagcaatatggtgacatggagcaaatctcaaaaaaccgatctcagttcggattgaagtctgcaactcgacttcatgaagtcggaatcgctagtaatcgtagatcagctacgctacggtgaatacgttctcgggtttt；

47、seq id no.343:atgaaacctattaaaatagctctaattggtgctggaaatgtcggaaattctttcctttatgcagcaatgaatcaaggacttgcat ccgagtatggaattattgatattaaccctgattttgccgatggtaatgcttttgattttgaagatgcctcagcttctttgccttttccgattagtgtctcccgttatgaatataaagatctaaaagatgctgattttattgtaattacagcgggaagaccacaaaaaccgggtgaaactcggcttgaattagtagctgataacatccgaattatccg ggaaattgcactaaaagtcaaagaaagtggctttagtggaataagtattattgttgctaatcctgttgatataattacaagggcttaccgggatgcttctggattttccgatcaaaaagttatcggtagtggaactgttttagatacagcaaggcttcaatttgcaatcgcaaaaagagcaaaagtatcgcctaattcggttcaggcctacgt gatgggtgaacatggtgattcatcttttgttgcttattcaaatattaaaattgccggtgaatgtttctgtgcttattctaaactaaccggaattgatagctcaaattacgaaaaagaacttgaatatccagtttctcgccgggcttatgaaattattaatcgtaaaagggcaacattttatggaattggtgcagctattgccaaaatagtttctaatattatcaaagatacaaaaaatattatgattgccggagcaaatttacgaggagaatacggatttcacggagtaaatatcggagttccagttgttttaggggcaaacggaattgaaaaaattattgagattagttttaatgataaagaaaaagaaaaatttgccaaatcagttgcaatcattgataaaatttatcaggatgcaattaaaaatatttaa；

48、seq id.no.344:ttactttttaacatagtttctaatcaacccgttaattaattcacttctttttgttaaacttcctttctctgcaaatgatttatcattaaatatt gccagcgtttttaatataattgtaggttcttttttagcgttttgttgtggttttttattttgttcgcctgggccgatttgataccaatcaagatgaaatcattctaaagtaaagaaatttggcaaggtgtctttagggttaatctcgaatttaagacgttttacacgttttgggtactttgttggaaaaaaataagaatttaccttaatcgaatccttgccag caagaatttcatataaataggtaccattctcaacaatttctttggttttaggtacattattatttgaattttgaactttaattacaagcccttttccttttctatcggctaaaagattaatccaattaccatcggaaatattttttgcatcaaaaactaaataaattgctccggtatataaagaagttgatatttctttttctggattagacgattttgactgtaa tttcaaaggtttctttagctctaaaccttgatcagtttgaattgcatcttctgatttaaatattaatttattatcacttaaatcttttaggataaattcttttttatcttttccttgattttgataattaattgttccatctaaaaacacatcgggattgaatttcttaattatatcataggcagatttattagaattaataatattattaagactaattttggactgagcc aaaattagattttgattagttttatcaactaatttaaaatcaaaaaatagcttatttcctaaagttgagatctcatattcgctttttgtattttcaagattataaatattagcgaaattaaaagctgttcaaatgcttgtcccaaatttttcattttctaatacagaatttgagctgcttgtggaattaggaagtgaattttgactagtttgaggcgatgaagt ggaaactggttgtgtttgctgactttgactttgacccttagcttcttctgcaaaagtgcttaccttgactgtttttgctgaattttctgttgttttagctagtgaaacctctggttttttcggttgtgtggggctatttttttctgttttttgagtatttgcctttgattttaagccctcaatcacggtttttagctcttgttttactttttcctggtcttggtcgactaa atattttcccgtatttaataaataaatgcttttaagaacttcttcacttggattttccaaattagtcactgtttttgctagttcaaaaagtcgatcaactcgctgttttatttcatttgaggataaagtttttgcatcttgatcttcaggcattgaaaattctttaactgcttttatcgttccaaacatttgggcaacagcggcttggtatttattaaaatcaactt ttagatcaacaaaaactggaagatcctggatgataaattttttatcaatagcttttcgttttaaagaagcagtaatttcaaagcgaattttttgattttcaactagttttttcttatcaacaacagaaatctgacttggatctaaaagtttgggaataatacttaaatagacagttccgattttggtattaagaaaaaaatttgtctcacttaaatcaaaaa gatctttaaattctttactttttgttaaaatttgggatgtatttacttttgaattcggagatccatatcaataatcagagaggctaattttatcttttactagtgccatttgcaaatcatctttggtttttaatttgccttgaagatttgtttcaagtcaggattttagaattttagaaatttcctgatttgaaatcgcgccgcgaacttcaagatttaaattcatag tttttttagttgaaatttgcactaaattaagtccaagaactaattttccatctttatttaacaaagttaataatttttttcggtccaaaactgggtctaattgataatctgggcctaaaaatacgggttctcctaaggaattataaagtgaaagactcgcttttgatgcaaccaaagctctttcaagtcgtgaaaatcaattacttcctctttcattttcaaa attttgggcaagcaaaatttggaattccatcaaagttagatttgctcttgaaagatcaacaaaagacttgcttgaatcaatttgactaaaatcaaaattagttctagcttgttctgtatttccaaagcctttaagtacaatttgttttgaataagttatttgatccttatcagattttgcataaataacaacatttttaattgaattttgatcaactactgcat tttcaagatcaaaacttactaaataatcattgtttattagttcacttaaatcaaaagcagaaacaagattataacgataaagatcacttttggcagcagttaaaactgtttttgccgatcattttttaaaattatctttaattttaagatttaaaacaattgaatcaaatttttcctgactaattttagcattttttgctacttttagctgactcgggatctgatt tagataagaataatatgatttattataagaattaattccgacaactgtaccaacagcggctgataaactaagactaattccggcaattgttgttattaatcaaaaaggttttttaagtaattttgctaacttcat。

49、优选的，所述引物组由引物组1和引物组2组成，所述引物组1包括seq id no.1～seq id no.302 中单数序号所示引物序列，所述引物组2包括seq id no.1～seq idno.302中双数序号所述引物序列。

50、本发明还提供了一种通过高通量靶向测序实现猪15种病原同时检测的多重pcr试剂，由pcr 试剂1和pcr试剂2组成，所述pcr试剂1包括所述的引物组1，所述pcr试剂2包括所述的引物组2。

51、本发明主要是针对病原基因的特异性引物，但因为各个测序公司本身的测序平台要求不一致，在合成引物序列时会根据不同平台添加相应的其他试剂；所述pcr试剂1和pcr试剂2中还包括pcr 扩增过程中所需的必要试剂，对于扩增体系的要求不同，可做适应性调整。

52、优选的，所述引物组1中各条引物在pcr试剂1中的浓度均为10nmol/μl；所述引物组2中各条引物在pcr试剂2中的浓度均为10nmol/μl。

53、本发明还提供了一种通过高通量靶向测序实现猪15种病原同时检测的试剂盒，包括所述的引物组或所述的多重pcr试剂。

54、本发明还提供了所述引物组或所述的多重pcr试剂或所述的试剂盒在构建同时检测猪15种呼吸道病原高通量扩增子测序文库中的应用。

55、本发明还提供了所述引物组或所述的多重pcr试剂或所述的试剂盒在同时检测猪15种呼吸道病原高通量扩增子测序中的应用。

56、本发明还提供了所述引物组或所述的多重pcr试剂或所述的试剂盒在检测待测样本中猪15种呼吸道病原基因中的应用。

57、本发明还提供了一种检测待检样本中猪15种呼吸道病原基因的方法，所述方法为非疾病诊断治疗目的，所述方法包括以下步骤：

58、1)用所述的多重pcr试剂中pcr试剂1和pcr试剂2分别对待测样本进行多重pcr扩增，得到多重pcr扩增产物1和多重pcr扩增产物2；

59、2)将所述多重pcr扩增产物1和所述多重pcr扩增产物2进行混合，制备扩增子文库；

60、3)测序所述扩增子文库，实现检测待测样本中猪15种呼吸道病原基因。

61、本发明的技术效果和优点：

62、本发明提供了一种通过高通量靶向测序实现猪15种病原同时检测的引物组及其应用，病原类型涵盖7种病毒性病原，即非洲猪瘟病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒(北美型、欧洲型)、伪狂犬病毒、猪圆环病毒(2型、3型)、猪瘟病毒、口蹄疫病毒和猪流感病毒；4种细菌性病原，即副猪嗜血杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌；以及4种其他类型病原，即猪附红细胞体、弓形虫、猪鼻支原体和猪肺炎支原体，具体涉及目标病原对应的靶标基因，每种病原包括2～8个靶标基因不等，共计42个靶标基因，旨在通过对目标病原靶标基因的测序手段来实现15种病原的同时快速检测，进而实现病猪多种病原的同时快速检测，将患病动物、感染病原以及病原靶标基因紧密关联。

63、本发明包括一套引物组合，称为primer pool，共包含151对引物，每对引物对应的扩增子片段大小范围是100-150bp，能够高效、特异地对病原靶标基因进行靶向扩增；并且提供一种针对15种猪呼吸道病原的42种靶标基因扩增子测序检测分析方法，该方法具有快速、高效、高靶向、特异性强等技术优点，适用于猪场患病猪的病原快速、准确与多病原同时诊断。