一种包含15种支原体qPCR快速检测试剂盒及其使用方法和应用与流程

：本发明涉及一种检测试剂盒及其使用方法和应用，具体涉及一种qpcr快速检测试剂盒及其使用方法和应用。

背景技术：

1、支原体，又称霉形体，在1898年被发现，是目前发现的最小的最简单的原核生物，大小为0.1-0.3微米，能通过滤器，呈高度多形态，支原体基因组为一环状双链dna，缺乏细胞壁，分子量小，唯一可见的细胞器是核糖体，大多数的支原体以球形为主，有三层结构的细胞膜具有极大的可变性，对人类和动物均具有一定的致病性并且能在无生命的人工培养基上生长繁殖。支原体的基因组多数为双链dna，散布于整个细胞中的拟核或者没有形成的核区中。支原体的细胞膜中含甾醇，对保持细胞膜的完整性起了很大作用，革兰氏染色不易着色，支原体的种种特性都足以说明它不易被检测和清除的特点。

2、国外调查发现，大约有二十多种支原体能够污染细胞，有的细胞株甚至会被两种以上的支原体同时污染。研究表明，污染细胞的支原体95％以上为以下四种：口腔支原体(m.orale)、精氨酸支原体(m.arginini)、猪鼻支原体(m.hyorhinis)、莱氏无胆甾原体(a.laidlawii)。另外，发酵支原体(m.fermentans)、人型支原体(m.hominis)、唾液支原体(m.salivarium)、肺支原体(m.pulmonis)及梨支原体(m.pirum)也很常见。支原体污染的来源主要包括工作环境的污染、操作者本身的污染(某些支原体在人体是正常菌群)、培养基的污染、被污染细胞造成的交叉污染、实验器材的污染以及制备细胞的原始组织及器官的污染等。

3、支原体对培养细胞的污染发生率高，据估计平均发生率在60％左右。同时又非常隐秘，早期不容易被发现，污染细胞后，首先会影响细胞的生长状态及形态，由于支原体的存在会导致培养基中支持细胞生长的营养物质减少，造成细胞生长缓慢甚至停止，还会导致细胞微管解聚，引起细胞一系列病变；也会影响细胞正常代谢和功能，蛋白质、dna、rna合成发生障碍、破坏细胞膜完整性、影响细胞信号传递、染色体发生异常；此外，支原体污染还会影响一些病毒在细胞中的产量、使恶性细胞致癌能力下降、影响淋巴细胞分化等。

4、病毒载体的制造过程包括各种基于贴壁或悬浮细胞生产培养的技术。病毒载体的生产大多依赖于在二维(2d)静态系统中培养的贴壁细胞。这些系统可以包括培养皿和t-flasks，但为了维持更大的规模，可以使用细胞工厂和滚瓶，若支原体污染了细胞，对于病毒载体的生产会造成极大的影响，同时慢病毒载体作为car-t细胞制备的原料，对于最终的药品安全性造成巨大的隐患。

5、目前生物制品，支原体检测常用的检测方法有传统的分离培养法、指示细胞培养法(dna染色法)、elisa法、pcr法等。分离培养法基本不会出现假阴性结果，因此被誉为支原体检测金标准。不过也存在两个弊端，一是检测时间太长，支原体要长出明显克隆至少需要4周时间；二是尽管可以检测绝大多数支原体种类，分离培养法也有力所不及的时候，例如猪鼻支原体(m.hyorhinis)。指示细胞培养法(dna染色法)则灵敏度比较低，因背景荧光的存在，细胞轻度支原体污染不易检出；细胞裂解死亡产生碎片也会被荧光染料染色被误认为是支原体染色所致造成假阳性；另外，荧光染色法一般要求培养无污染的指示细胞作为对照，增加了检测的工作量。

6、pcr法为主流的支原体检测手段。支原体作为一种原核生物，其rrna基因是由保守和多变序列间隔排列而成，以其16srrna核酸序列中高度保守序列设计引物，采用pcr扩增、琼脂糖电泳的方法检测细胞中的支原体污染，pcr法虽然比传统分离培养法检测时间大大缩短，不过已有的pcr支原体检测也存在一些问题，如引物设计不好，导致检测的灵敏度及特异性不够；而且，现在主流的检测试剂盒只能针对某一种或几种支原体，广谱性差。zl202210318135.7公布了采用微滴式数字pcr检测鸡毒支原体的组合物及其应用，其只能检测一种支原体，通量较低，zl 202210646129.4采用lamp-taqman技术检测鸡毒支原体，也存在通量较低，应用范围窄的问题，zl202111573467.1一种用于细胞培养中检测支原体污染的pcr试剂盒及其应用公开了一种可以扩增多种支原体的引物，但检测过程复杂，耗时耗力。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于支原体qpcr快速检测的试剂盒及其使用方法，本发明试剂盒可快速检测细胞库样品，病毒载体样品中是否存在支原体污染，本发明具有灵敏度高、数据准确可靠、操作简单、检测快速的特点。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

3、一种同时扩增15种支原体qpcr快速检测试剂盒，包括以下组分：用于特异性扩增15种支原体的15组引物对；所述15种支原体分别为：莱氏无胆支原体、精氨酸支原体、发酵支原体、鸡毒支原体、生殖支原体、人型支原体、猪鼻支原体、猪肺炎支原体、口腔支原体、梨支原体、肺炎支原体、唾液支原体、滑液支原体、咽支原体和耳支原体；所述15种支原体对应的引物对和引物浓度如表1所示：

4、表1

5、

6、

7、pcr是一个复杂的分子动力学过程。随着复合扩增系统中引物数量的增加，不同引物之间的相互干扰越来越严重，反应体系的动力学变得越来越复杂，因此需要设计和修改大量特异性引物并进行复杂的测试，摸索复合扩增系统中各引物之间最优的浓度比例，，最终保证不降低试剂盒特异性及灵敏度的前提下复合检测更多的支原体，本发明通过复杂的设计和实验摸索确定如下表的引物序列及对应的浓度，如表1。

8、进一步的，上述检测试剂盒还包含以下组分：如下表2所示：

9、表2

10、

11、本发明试剂盒因为需要满足不同样品的适应性及不同退火温度的耐受性，所以需要测试不同的pcr扩增程序，最终扩增程序如下：

12、步骤1 95℃10min；

13、步骤2 95℃15s；

14、步骤3 60℃60s；

15、步骤2至步骤3重复40次循环，并接收荧光信号；

16、步骤4 95℃15s；

17、步骤5 60℃60s；接收荧光信号。

18、步骤6 95℃15s。

19、优选地，本发明试剂盒的扩增产物采用qpcr方法检测。

20、本发明pcr试剂盒用于检测细胞基因治疗产品，如细胞库支原体检测，慢病毒(lvv)载体支原体检测等。

21、本发明的优点是：

22、1.本发明创造性通过设计，获得15种支原体实时荧光pcr检测引物组合，结合了实时荧光定量pcr快速的特点，比传统分离培养法检测支原体时间大大缩短。

23、2.本发明是在实时荧光定量pcr技术平台的基础上，对支原体特异性靶标基因进行定性检测，一次实验可检测多个样本，具有快速、特异、经济等特点，极大的降低了细胞基因治疗样品支原体检测成本。

24、3.本发明中使用自主设计的阳性对照，分别将15种支原体的靶序列构建到3个t载体质粒上，有效避免提取过程中阳性菌株对试剂盒和环境的污染。

25、4.本发明提供的技术方案适用于产业化，高效简便，为细胞基因治疗产品中支原体污染的防控提供了更高水准的检测方法。

26、5.本发明经过大量实验、反复测试验证，最终得到最佳的引物及浓度配比，避免假阳性扩增。