一种凡纳滨对虾精氨酸激酶基因LvAK1及其应用的制作方法

本发明属于水产养殖分子生物学领域，具体涉及一种凡纳滨对虾精氨酸激酶基因 lvak1及其应用。

背景技术：

1、凡纳滨对虾（ litopenaeus vannamei），又称白对虾（pacific white shrimp）、南美白对虾，是世界最重要的水产养殖品种之一，占据了世界对虾总产量的76%，其养殖区域遍布世界各地。凡纳滨对虾同样也是我国对虾养殖的主导品种，该品种1988年从美国引进我国，自1999年开始在我国大规模养殖，至2013年年产量可达140万吨左右，占我国对虾养殖总产量的80%以上。

2、随着经济养殖规模的不断扩大，凡纳滨对虾种质退化、抗病力下降、商品虾规格小、个体生长差异大等问题持续凸显，对养殖过程中的监控和对优良种质的需求日益迫切。然而长期以来，缺少合适的方法来检测养殖过程中对虾的生长状态，相较于传统的养殖和遗传选育方法，分子标记辅助监测和遗传选育具有操作简单、准确性和可靠性高等特点，可以用于对虾生产实践。

3、精氨酸激酶（arginine kinase, ak, ec 2.7.3.3）属于磷酸原激酶家族中重要成员，是无脊椎动物中能量代谢调控过程中的关键酶，广泛分布于无脊椎动物如昆虫、虾、蟹及软体动物中。ak起着类似于脊椎动物中肌酸激酶(creafine kinase, ck)的作用，当机体需要atp时，磷酸肌酸中的高能磷酸键在ck的作用下被转移形成atp；在机体的atp达到饱和时，ck催化合成磷酸肌酸，贮存能量。而无脊椎动物体内的主要储能物质是磷酸精氨酸（arginine phosphate），ak通过催化磷酸精氨酸使高能磷酸键被转移至adp生产出atp作为细胞的直接能量来源，或在细胞能量需求较低时将过剩的能量储存起来。因此ak是极为有效的能量缓冲系统，在无脊椎动物的各种生理活动中发挥至关重要的作用。

4、近年的研究表明，能量代谢在甲壳动物等无脊椎动物的适应外界环境、生长和免疫反应中起到重要作用，如日本对虾的ak基因在缺氧条件下上调[1]；中华绒鳌蟹在长期低浓度重金属属（cd2+)暴露后，精氨酸激酶含量下调[2]。在我们的近期研究中发现热胁迫后肌肉中 lvak1的表达显著下调，在生长快速的群体中 lvak1基因高表达；在副溶血弧菌和白斑综合症病毒感染的凡纳滨对虾中，  lvak1的表达也显著下调，这表明 lvak1与对虾快速生长和环境适应有直接关系。在绿盲蝽和蝗虫中研究报道通过精氨酸激酶基因检测昆虫的生境适合度[3; 4]。因此在对虾的养殖中，检测ak基因表达也可能作为一个生长和生境适合状态的分子指标，用于凡纳滨对虾生长状态监测及生长性状遗传育种。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种凡纳滨对虾精氨酸激酶基因 lvak1及其应用。

2、为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

3、一种凡纳滨对虾精氨酸激酶基因 lvak1，所述的凡纳滨对虾精氨酸激酶基因 lvak1的cdna序列如seq id no.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、一种检测上述的凡纳滨对虾精氨酸激酶基因 lvak1的mrna表达水平的实时荧光定量pcr试剂盒，所述的实时荧光定量pcr试剂盒包括检测引物对和内参引物对，所述检测引物对包括正向引物lvak1-rtf1和反向引物lvak1-rtr1，内参引物对包括用于检测凡纳滨对虾内参基因18s rrna的正向引物18s-f和反向引物18s-r；

5、其中，正向引物lvak1-rtf1和反向引物lvak1-rtr1的核苷酸序列为：

6、lvak1-rtf1：5'-tcctctaccctttctagccttg-3'，

7、lvak1-rtr1：5'-agtggtcgtcgatcagcttctg-3'；

8、其中，正向引物18s-f和反向引物18s-r的核苷酸序列为：

9、18s-f：5'-tatacgctagtggagctggaa-3'，

10、18s-r：5'-ggggaggtagtgacgaaaaat-3'。

11、一种上述的实时荧光定量pcr试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

12、1）取凡纳滨对虾组织，提取总rna，反转录成cdna，以反转录得到cdna为模板，通过实时荧光定量pcr扩增凡纳滨对虾精氨酸激酶基因 lvak1；

13、2）采用2-△△ct法计算所述凡纳滨对虾精氨酸激酶基因 lvak1的相对表达量。

14、进一步的，上述的凡纳滨对虾组织为凡纳滨对虾的肌肉和/或血液组织。

15、上述的凡纳滨对虾精氨酸激酶基因 lvak1在监测凡纳滨对虾生长发育状态中的应用。

16、上述的凡纳滨对虾精氨酸激酶基因 lvak1在评价对凡纳滨虾养殖环境适宜性中的应用。

17、上述的凡纳滨对虾精氨酸激酶基因 lvak1在鉴定/筛选/培育生长速度快的凡纳滨对虾遗传资源中的应用。

18、本发明的优点如下：本方法提供的凡纳滨对虾精氨酸激酶基因 lvak1可用于从分子水平上快速检测养殖对虾的生长状态，不受外界环境及个体大小的限制，且能够在早期进行选择，提高对虾养殖过程中的监控效率和准确率，能降低养殖成本；同时可能够应用于对虾亲本的生长性状遗传选育，提高对虾产量。

技术特征：

1.一种凡纳滨对虾精氨酸激酶基因lvak1，其特征在于：所述的凡纳滨对虾精氨酸激酶基因lvak1的cdna序列如seq id no.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

2.一种检测如权利要求1所述的凡纳滨对虾精氨酸激酶基因lvak1的mrna表达水平的实时荧光定量pcr试剂盒，其特征在于：所述的实时荧光定量pcr试剂盒包括检测引物对和内参引物对，所述检测引物对包括正向引物lvak1-rtf1和反向引物lvak1-rtr1，内参引物对包括用于检测凡纳滨对虾内参基因18s rrna的正向引物18s-f和反向引物18s-r；

3.一种如权利要求3所述的实时荧光定量pcr试剂盒的使用方法，其特征在于:包括如下步骤：

4.根据权利要求4所述的使用方法，其特征在于：所述的凡纳滨对虾组织为凡纳滨对虾的肌肉和/或血液组织。

5.如权利要求1所述的凡纳滨对虾精氨酸激酶基因lvak1在监测凡纳滨对虾生长发育状态中的应用。

6.如权利要求1所述的凡纳滨对虾精氨酸激酶基因lvak1在评价对凡纳滨虾养殖环境适宜性中的应用。

7.如权利要求1所述的凡纳滨对虾精氨酸激酶基因lvak1在鉴定/筛选/培育生长速度快的凡纳滨对虾遗传资源中的应用。

技术总结
本发明属于水产养殖分子生物学领域，具体涉及一种凡纳滨对虾精氨酸激酶基因LvAK1及其应用。本发明通过基因表达分析和生长情况分析，在凡纳滨对虾精氨酸基因LvAK1上设计RT‑qPCR扩增引物LvAK1‑RTF1/R1，该引物扩增得到的LvAK1基因表达量与对虾养殖过程中的生长状态显著相关。LvAK1基因的高表达代表凡纳滨对虾处于生物适应度高的适宜生长状态。本发明所涉及的LvAK1基因可以作为检测凡纳滨对虾对环境的适应程度和生活力的分子标记，用于监测对虾生长状态和辅助对虾生长性状的遗传选育。

技术研发人员：杨铭,张晓军,黄永强,游小艇,杨小强,马鸿媚,翁蓁洲,王伟
受保护的技术使用者：福州市海洋与渔业技术中心
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11