一种提高细胞抗高pCO2环境压力的培养方法与流程

一种提高细胞抗高pco2环境压力的培养方法
(1)技术领域
1.本发明属于生物制药领域，特别是哺乳动物细胞批次补料培养技术领域，涉及抵抗高二氧化碳分压，在低ph培养条件下降低抗体蛋白中五聚甘露糖(man5)修饰比例的方法。
(2)

背景技术：

2.在生物制药领域，抗体类药物被广泛应用于疾病治疗，高聚甘露糖型是抗体n-糖基化修饰中一种常见的非成熟化糖型，cho细胞表达抗体的高聚甘露糖型主要是man 5(五聚甘露糖型)，高比例的man 5使抗体在人体中的清除效率增加，从而影响抗体类药物的药物代谢动力学和药效动力学参数，因此man 5水平常是抗体类药物的一个重要质量参数，降低man 5水平往往是新药或生物类似药开发过程中追求的目标。目前，本领域中对于ph和man5水平的关联以及究竟如何控制并不明确。
3.相反，在细胞培养工艺开发或生产过程中，常常无法避免培养体系中pco2过高的情况发生。放大生产时，因大规模生物反应器的o2传质能力增强，co2溢出难度增大，pco2随之升高，培养液ph降低，于是需要大量碱液na2co3加入，加剧pco2升高，如此恶性循环；工艺开发时，为满足某些产物蛋白质量调节的需求，如糖型比例的调节，需要采用传统的低ph工艺，co2也将被大量通入，因此产生较高的pco2。大量研究数据表明，细胞在高pco2环境下容易发生有氧代谢异常，乳酸因此持续累积，伴随而来的是细胞活率下降、蛋白产量降低以及蛋白质量改变，严重时有可能导致整批生产或工艺应用的失败[1]。虽然这一问题引起了行业从业人员和学者对为什么高pco2会产生如此严重的负面影响以及如何降低培养体系中的pco2进行了大量的研究，但目前并无切实有效的提高细胞抗高pco2环境压力的方法[2]。
[0004]
有研究提出，过量co2在胞内水合后产生大量的h+和hco3-，胞内环境因此过度酸化，同时hco3-可能会形成过氧化物hco4-，这些变化也许会对线粒体功能造成不可逆的损害，从而导致细胞在高pco2环境中培养表现恶化[3]。
[0005]
事实上，co2在胞内的关键水合反应并非在胞质中溶解后自然发生，而是由碳酸酐酶(ca,ec 4.2.1.1)催化后快速反应，以迅速满足糖酵解和有氧代谢通路中对底物hco3-有需求的反应。哺乳动物细胞一共有14种碳酸酐同工酶，其中位于细胞质的ca ii和位于线粒体膜上的ca v主要负责co2的可逆水合反应，并且ca v是唯一位于线粒体上的碳酸酐酶，也是维持线粒体tca循环正常运转的关键酶之一，其对co2的催化转换常数(kcat)高达3
×
105s-1[4]，在高pco2环境下，它催化co2的过量水合有可能是造成线粒体受损的最直接原因。根据前人的研究，磺胺类物质对ca酶有较强的抑制作用，其中最有效的为乙酰唑胺(分子结构如图1)，其抑制常数为58nm,同时它还对有相同功能的ca ii有同级别的抑制作用(ki＝10nm)，而对其他同工酶的抑制作用较弱[5]。
[0006]
然而，现有技术中没有提供任何有关于如何在高pco2下保护细胞抵抗环境压力，又能够避免高man5糖型修饰的抗体生产的方法。
(3)

技术实现要素：

[0007]
对此，本发明的一个目的是提供一种在抗体生产过程中，有效维持低ph培养条件以及降低man5水平的方法，该方法包括在表达抗体的细胞培养过程中添加乙酰唑胺。
[0008]
本发明的还有一个目的是提供乙酰唑胺在在抗体生产过程中，有效维持低ph培养条件以及降低man5水平的用途。
[0009]
在本发明的一个方面，提供了一种用乙酰唑胺减少细胞培养生产的抗体蛋白中的五聚甘露糖的方法，该方法包括以下步骤：
[0010]
a)接种细胞并在36-37℃，优选36.5℃下培养；
[0011]
b)在细胞生长到8-30x106细胞/ml的细胞密度，优选15.0x106细胞/ml时，降低培养温度至30-32℃，优选31℃，在降温日通过通入co2使ph从7.00
±
0.20范围的第一ph下降至范围在6.7-6.90，优选6.80的第二ph，所述第一ph大于第二ph，维持该ph直到收获细胞；
[0012]
c)在b)步骤中，在降低温度同时添加乙酰唑胺，其浓度为50μm-150μm，优选为150μm；和
[0013]
d)收获细胞并收集抗体蛋白产物。
[0014]
在本发明的另一个方面中，提供了一种抗体生产方法，该方法包括以下步骤：
[0015]
a)接种细胞并在36-37℃，优选36.5℃下培养；
[0016]
b)在细胞生长到8-30x106细胞/ml的细胞密度，优选15.0x106细胞/ml时，降低培养温度至30-32℃，优选31℃，在降温日将pco2从20mmhg-60mmhg的第一pco2提高到高于80mmhg，优选80mmhg-200mmhg的第二pco2，所述第二pco2高于第一pco2，维持pco2直至收获细胞，可任选地所述pco2的提高是通过将二氧化碳的通气比例从6％以下提高到8-30％，优选15％co2；
[0017]
c)在b)步骤中，在降低温度同时添加乙酰唑胺，其浓度为50μm-150μm，优选为150μm；和
[0018]
d)收获细胞并收集抗体蛋白产物。
[0019]
在本发明上述方面的优选实施方式中，在步骤(a)中，ph维持在7.0
±
0.20范围内。
[0020]
在本发明上述方面的另一个优选实施方式中，在步骤(a)中，pco2维持在6％或以下。
[0021]
在本发明上述方面的还有一个优选实施方式中，步骤(a)的培养中用20mmhg-60mmhg，优选30mmhg的pco2分压培养细胞，可任选地，所述pco2分压通过通入通气比例为6％以下的二氧化碳实现。
[0022]
在本发明的一个具体实施方式中，细胞是哺乳动物细胞，可衍生自哺乳动物，例如人类和非人灵长类动物，以及兔、大鼠、小鼠、山羊、猪和其他哺乳动物物种。在优选实施方案中，哺乳动物是人。在另一个实施方式中，细胞优选cho细胞。
[0023]
在本发明的一个实施方式中，抗体蛋白是单克隆抗体或多克隆抗体，或其抗原结合片段。在一个优选实施方式中，抗体是igg抗体，选自是igg1,igg2,igg3,igg4以及具有igg fc端结构的融合蛋白。在更优选的实施方式中，抗体蛋白选自igg1和具有igg1 fc端结构的融合蛋白。
[0024]
在本发明的另一个方面，提供了乙酰唑胺用于减少细胞培养中的乳酸累积的用途，其特征在于，在ph低于7.0，优选ph6.8或co2分压大于80mmhg或co2通气比例大于6％，优
选8-30％的细胞培养期间添加50-150μm的乙酰唑胺。
[0025]
在本发明的另一个方面，提供了乙酰唑胺用于减少通过细胞培养后产出的抗体蛋白的五聚甘露糖比例的用途，其特征在于，在ph低于7.0，优选ph6.8，或co2分压大于80mmhg或co2通气比例大于6％，优选8-30％的细胞培养期间添加50-150μm的乙酰唑胺。
[0026]
本发明的优点在于：在培养细胞生产抗体的过程中使用乙酰唑胺来消除高pco2压力，改善低ph高pco2培养时乳酸的积累，维持理想的细胞活率和产量，因此提高了细胞抗高co2分压的能力。其次，在细胞培养中的五聚甘露糖水平保持低水平，从而对于维持抗体理想的药代动力学和药效动力学提供了稳定作用。
[0027]
各种实施方式的其它特征和优势将在下面的说明书中进行部分阐述，并且部分地根据说明书其将是显而易见的，或者可以通过各种实施方式的实践得到了解。各种实施方式的目标和其它优势将通过特别是在说明书和所附权利要求书中所指出的要素及组合得以实现和达到。
[0028]
除非另外指出，本发明采用的试剂、细胞、以及仪器装置都是普通的市售和公众可得的。
(4)附图说明
[0029]
图1显示了缓解高pco2压力实验组中活细胞密度随时间变化曲线图。可以见到与加入乙酰唑胺相比，在高pco2下活细胞的密度在对照中随着时间下降的趋势要更剧烈。
[0030]
图2显示了缓解高pco2压力实验组中细胞活率随时间变化曲线图。可见在高co2分压的情况下对照组的细胞活率在第14天下降了10％，而乙酰唑胺组则仅下降了少于5％。
[0031]
图3显示了高pco2压力实验组中乳酸浓度随时间变化曲线图。可见在第10天后，对照组的乳酸堆积大量增加，是乙酸唑胺两种不同浓度组的2-3倍之多。
[0032]
图4显示了缓解高pco2压力实验组的离线pco2随时间变化曲线图。可见乙酸唑胺并不会导致环境中co2的压力有实质性的消除，而是与对照组一致，维持高co2压力，乙酰唑胺在这种压力情况下改善了其它的生理参数和代谢速率，表现为图2和图3。
[0033]
图5显示了乙酰唑胺与低ph工艺联合组的活细胞密度随时间变化曲线图。可见在降温后的低ph下不加入乙酰唑胺的活细胞密度明显低于加入乙酰唑胺的密度；后者与在高ph下培养的活细胞密度基本相当。
[0034]
图6显示了乙酰唑胺与低ph工艺联合组中细胞活率随时间变化曲线图。无论是高ph(7.2)对照组或是不添加乙酰唑胺的ph6.8
±
0.1的组中，12天后细胞活率都急剧下降，低ph和高co2的压力下细胞大量死亡，在收获时(接近14天)时死亡率接近30％，而添加了乙酰唑胺的组显著缓解了这种压力，仅有少于10％的细胞死亡。
[0035]
图7显示了乙酰唑胺与低ph工艺联合组中乳酸浓度随时间变化曲线图。可见在低ph组+乙酰唑胺组和高ph对照组中，14天左右的乳酸浓度趋势相似，而未加乙酰唑胺的低ph组中乳酸浓度急剧增加。
[0036]
图8显示了乙酰唑胺与低ph工艺联合组中在线ph随时间变化曲线图。可见在实验组(ph6.8
±
0.1)组在降温日后一天调整ph策略至6.8
±
0.1，随后ph明显下降至6.90后一直维持至培养结束。对照组(ph7.0
±
0.2)组在降温后，ph逐步恢复至7.20，在第12天出现小幅波动(下降至7.05后回升至7.20)，可能由当天乳酸的小幅波动导致。实验组加入乙酰唑胺
后的ph保持稳定。
[0037]
图9显示了乙酰唑胺与低ph工艺联合组中的离线pco2随时间变化曲线图。该图显示了在高ph下pco2的分压保持稳定，而在低ph和添加高pco2时co2的分压一直维持在一个大于80mmhg的范围，对于培养物造成压力。
[0038]
图10显示了乙酰唑胺与低ph工艺联合组：蛋白产量与质量结果。如x轴下方的表格所示，添加乙酰唑胺后蛋白质产量比起不添加乙酰唑胺的低ph组每升增加了大约23.5％而其man5的比例保持不变，有效降低了低ph工艺的负面作用，而且与高ph相比man5的水平降低了大约1.1％。
(5)具体实施方式
[0039]
现在将详细地参考本发明的一些实施方式，其中的实例在附图中被阐述。尽管本发明结合图解的实施方式进行描述，但是应当理解，它们并非意图使本发明限于那些实施方式。相反，本发明意图覆盖可以被所附权利要求书限定的本发明包括在内所有替换、修改和等价物。
[0040]
应当理解，如此处的说明书和权利要求书全文中所使用，“一个”、“一种”和“该”的含义包括复数指代对象，除非上下文另有明确规定。
[0041]
除非以其它方式从上下文显而易见，否则当值表示为“约”x或“大约”x时，所陈述的x值将理解为精确到
±
10％。
[0042]
在本公开中，当时间段或持续时间或间隔的长度以天表示，时间点以天表示时，这意味着时间或定时以天计算或识别，其中数字不一定精确地表示24小时的倍数。
[0043]
本发明的核心技术方案是在细胞培养过程中，在批次补料培养的降温日或者任何需要缓解高pco2环境压力的时间点添加乙酰唑胺。
[0044]
本文所述的“降温日”指的是细胞在37℃培养后达到高细胞密度(例如，15.0x106细胞/ml)后降低温度从而控制细胞增殖而在长时间内保持高活力(生产率)的日期。
[0045]
在降温日前的细胞培养步骤中可使用常规的培养条件，如在36-37℃下，优选36.5℃，以及低pco2环境压力下，例如在二氧化碳分压为20-60mmhg，优选20-50mmhg条件下培养细胞。
[0046]
本文所述的“高pco2环境压力”指pco2高于80mmhg，优选80-200mmhg，更优选80mmhg、100mmhg、120mmhg、150mmhg的二氧化碳分压。“常规pco2条件”为pco2小于60mmhg的条件，高pco2条件下引起的细胞乳酸严重积累，细胞活率和蛋白产量下降的情形，可由本领域技术人员可通过实时监测co2分压，并结合乳酸累积和活率下降等表现确定pco2对细胞培养和生产的压力和影响。本文所述的co2分压可任选地通过常规方法，例如由改变co2的通气比例实现，例如，通入8-30％通气比例的二氧化碳，相对于常规6％以下的通气比例实现了二氧化碳分压的提高。
[0047]
本文所述的“抗体”或“抗体蛋白”是指通过身体对存在抗原的反应生成，并且结合于抗原，以及抗原结合片段和其经工程改造变异体的免疫球蛋白。因此，术语“抗体”包括例如完整单克隆抗体(例如使用杂交瘤技术生成的抗体)和抗原结合抗体片段，如f(ab')2和fab片段。也包括基因工程改造完整抗体和片段，如嵌合抗体、人源化抗体、单链fv片段、单链抗体、双功能抗体、微型抗体、线性抗体、多价或多特异性(例如双特异性)杂交抗体等等。
因此，术语“抗体”扩张性地用以包括任何包含抗体的抗原结合位点并且能够特异性结合于其抗原的蛋白质。术语“抗体”还包括抗体自身(“裸抗体”)或与细胞生长抑制药物或细胞毒性药物结合的抗体。
[0048]
本发明的核心技术方案是在细胞在高co2分压和低ph的压力存在下培养细胞时，在压力情况下添加乙酰唑胺，从而出乎意料地改善细胞培养的效果，逆转了高压力下的不良影响，又利用这些压力使得细胞能够较好地生产所需的抗体蛋白，并且将其man5的糖型比例限制在符合抗体制备中所需的低比例。
[0049]
本发明的实施例中的实验数据证明了，首先，在模拟大规模生产的高pco2条件下，有两个以上的克隆有如下表现：与常规pco2条件(pco2《60mmhg)相比，高pco2条件下(pco2》80mmhg)，细胞乳酸严重积累，细胞活率和蛋白产量均有所降低，而在此基础上添加乙酰唑胺后，这一情况大大改善，乳酸的降幅最高可达90％，活率提高在15％-25％之间，蛋白产量也维持在更高的水平。这一结果充分说明添加乙酰唑胺可以大大提高细胞抗高pco2环境压力的能力。
[0050]
另外，与传统低ph工艺相比，添加乙酰唑胺后，不仅五聚甘露糖水平仍然保持在低水平状态，而且细胞培养的整体表现都得到了改善，包括乳酸代谢状态、细胞活率和蛋白产量。由此可见，乙酰唑胺的添加使得降低man5的低ph工艺得到了进一步优化。
[0051]
现在已经概括地描述了本发明，通过参考下述实施例的下述内容，可以更容易地理解本发明，这些实施例通过例证的方式提供并且并非意图限定本发明，除非明确指出。
[0052]
除非以其它方式专门指定，否则本发明的任何特征、步骤、要素、实施例或方面可与任何其它特征、步骤、要素、实施例或方面组合使用。尽管出于清楚和理解的目的已经借助于说明和实例相当详细地描述了本发明，但显而易见可在所附权利要求书的范围内实践某些变化和修改。
[0053]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文特别提及的所有出版物和专利出于所有目的通过引用并入。本说明书中引用的所有引用均应被视为本领域技术水平的指示，这不应被解释为承认本发明由于现有发明而无权提前公开。
[0054]
实施例1乙酰唑胺对高pco2环境压力下细胞发酵的影响
[0055]
1.设备和试剂：
[0056]
1.1设备信息
[0057][0058]
1.2试剂信息
[0059]
材料缩写厂商货号cell boost
tm 7anahyclone
tm
sh31026.04cell boost
tm 7bnahyclone
tm
sh31027.02cnactiprotmnahyclone
tm
sh31037.01乙酰唑胺na麦考林59-66-5l-谷氨酰胺glnjtbaker2078-06无水葡聚糖glucosejt baker1919-09ht添加剂htgibco11067030杀稻瘟菌素s hclbsgibcoa11139博来霉素筛选抗生素zeocininvitrogenr25001碳酸氢钠nahco3merck1.37013.2500盐酸,6.0n溶液hcljt.baker0327-02碳酸氢钠nahco3merck1.37013.2500碳酸钠na2co3merck1.06398.5000泊洛沙姆188namerck1.37065.1000消泡剂antifoamhyclone
tm
sh30897.01
[0060]
2.试验方法：
[0061]
2.1 3mm乙酰唑胺母液的配制，配制步骤如下(以1l水溶液为例)：
[0062]
a.记录所用配液容器重量
[0063]
b.记录所用超纯水温度
[0064]
c.在配液容器中加入0.99kg超纯水，加热并保持温度在70℃
[0065]
d.称量0.67g乙酰唑胺，加至超纯水中，搅拌至完全溶解
[0066]
e.加入超纯水定容，记录最终重量
[0067]
f.混合15-30分钟
[0068]
2.2添加乙酰唑胺的方法(以150um添加浓度为例)
[0069]
在培养液中以添加物形式单次添加，添加体积计算公式如下：
[0070]
若细胞培养体积为v，则3mm乙酰唑胺的添加体积vi＝(0.15
×
v)/3
[0071]
2.3细胞培养步骤：
[0072]
2.3.1通用批次补料培养工艺步骤：
[0073]
2.3.1.1接种：将cho细胞以0.4x106细胞/ml密度接种至基础培养基actipro。
[0074]
2.3.1.2补料：在接种日起第3，5，7，10，12天进行补料，补料量：cb7a7b(cb7a:cb7b＝10:1)3％，3％，3％，3％，2％。
[0075]
2.3.1.3温度：初始培养温度为36.5℃，当活细胞密度》15.0x106细胞/ml后降温至31.0℃。
[0076]
2.3.1.4ph：7.0
±
0.2
[0077]
2.3.1.5收获：培养至第14天离心收集培养上清液。
[0078]
2.3.1.6分析检测：将收获液上清经0.22μm滤膜过滤后进行抗体表达量检测及糖基化分析。
[0079]
2.3.2高pco2压力实验组工艺步骤
[0080]
如2.3.1所示进行培养接种，除了接种日至降温前控制pco2水平为6％，降温后至收获日提高pco2水平至15％。
[0081]
2.3.3低ph工艺实验组工艺步骤
[0082]
如2.3.1所示进行培养接种，接种日至降温前ph控制为7.0
±
0.2；降温后至收获日对照条件ph控制为7.0
±
0.2保持不变；实验条件ph控制策略均调整为6.8
±
0.1。(其中ph上限通过通入co2实现控制，ph下限通过加入1m na2co3实现控制。)
[0083]
2.3.4乙酰唑胺与低ph或高pco2工艺联合组工艺步骤
[0084]
如2.3.2或2.3.3所示进行培养接种，接种日至降温前ph控制为7.0
±
0.2或pco2控制为6％；降温后至收获日ph控制策略均调整为6.8
±
0.1(其中ph上限通过通入co2实现控制，ph下限通过加入1m na2co3实现控制。)维持pco2为6％，或pco2调整至15％。
[0085]
添加乙酰唑胺母液：降温日或通过实时监测co2分压，并结合乳酸累积和活率下降等在任何需要缓解高pco2环境压力的时间点调整pco2浓度，调整完毕添加乙酰唑胺母液。
[0086]
2.4检测方法：
[0087]
活细胞密度使用vi-cell进行细胞计数检测，乳酸浓度使用cedex自动化多功能生物化学分析仪进行检测，离线ph和pco2使用bga血液气体分析仪进行检测，所有检测方法如厂商说明书所示。
[0088]
蛋白表达量和糖基化分析：细胞培养液上清经0.22μm滤膜过滤，protein-a亲和高效液相色谱分析方法测定抗体表达量；糖基化分析方法为hilic(亲水作用液相色谱，halo penta-hilic,2.1
×
150mm,2.7μm)。
[0089]
3.检测结果：
[0090]
本发明的实验效果对比主要通过两组实验呈现，第一组为缓解高pco2压力实验组，体现了添加乙酰唑胺可以有效提高细胞抗高pco2环境压力的能力；第二组为乙酰唑胺与低ph工艺联合调控组，体现了在低ph工艺中添加乙酰唑胺可以有效纠正低ph导致的高pco2对细胞培养表现的负面影响，同时不影响其降低五聚甘露糖水平的能力。
[0091]
图1至图4显示了缓解高pco2压力实验组效果对比。
[0092]
在高pco2培养环境下，添加乙酰唑胺可显著降低培养后期的乳酸水平和提高细胞收获活率，同时，添加乙酰唑胺后蛋白产量更高；且高添加浓度(150um)的实验效果比低添加浓度(50um)更明显(见表1)。
[0093]
表1高pco2压力实验组的蛋白产量
[0094][0095]
图5到图10显示了乙酰唑胺与低ph工艺联合组的试验结果。与对照ph(7.0
±
0.2)相比，低ph工艺(6.8
±
0.1)可以显著降低五聚甘露糖水平，但是该工艺条件下pco2水平最高可达200mmhg，在这一高pco2环境压力下，活细胞密度下降，细胞活率快速下降，培养后期
的乳酸水平持续升高，最终蛋白产量降幅超25％(见图10)；而添加乙酰唑胺可以有效减少低ph工艺的负面作用，同时保持了低五聚甘露糖水平不变(图10)。
[0096]
综上所述，在模拟大规模生产的高pco2条件下，与常规pco2条件(pco2《60mmhg)相比，高pco2条件下(pco2》80mmhg)，细胞乳酸严重积累，细胞活率和蛋白产量均有所降低，而在此基础上添加乙酰唑胺后，这一情况大大改善，乳酸的降幅最高可达90％，活率提高在15％-25％之间，蛋白产量也维持在更高的水平。这一结果充分说明添加乙酰唑胺可以大大提高细胞抗高pco2环境压力的能力。
[0097]
另外，与传统低ph工艺相比，添加乙酰唑胺后，不仅五聚甘露糖水平仍然保持在低水平状态，而且细胞培养的整体表现都得到了改善，包括乳酸代谢状态、细胞活率和蛋白产量。由此可见，乙酰唑胺的添加使降五聚甘露糖的低ph工艺得到了进一步优化。
[0098]
参考文献
[0099]
[1]xu s,jiang r,mueller r,等.probing lactate metabolism variations in large-scale bioreactors[j/ol].biotechnology progress,2018,34(3):756-766.https://doi.org/10.1002/btpr.2620.
[0100]
[2]zhang x,moroney j,hoshan l,等.systematic evaluation of high-throughput scale-down models for single-use bioreactors(sub)using volumetric gas flow rate as the criterion[j/ol].biochemical engineering journal,2019,151:107307.https://doi.org/10.1016/j.bej.2019.107307.
[0101]
[3]brunner m,doppler p,klein t,等.elevated pco
2 affects the lactate metabolic shift in cho cell culture processes[j/ol].engineering in life sciences,2018,18(3):204-214.https://doi.org/10.1002/elsc.201700131.
[0102]
[4]heck r w,tanhauser s m,manda r,等.catalytic properties of mouse carbonic anhydrase v.[j/ol].journal of biological chemistry,1994,269(40):24742-24746.https://doi.org/10.1016/s0021-9258(17)31454-0.
[0103]
[5]franchi m,vullo d,gallori e,等.carbonic anhydrase inhibitors:inhibition of human and murine mitochondrial isozymes v with anions[j/ol].bioorganic&medicinal chemistry letters,2003,13(17):2857-2861.https://doi.org/10.1016/s0960-894x(03)00581-x.