1.本发明涉及一种肠癌类器官的新型高速培养方法，属肠癌类器官培养技术领域。
背景技术：
2.大肠癌的分类是比较复杂的，通常指的是病理学分类，临床上比较常见的有腺癌，黏液癌，印戒细胞癌等，临床上比较多的腺癌，往往是由于腺瘤性息肉变来的，腺瘤性息肉就很常见了，在50-60岁的患者身上做肠镜的检查，经常会发现这种小的腺瘤性息肉。这种息肉的经过一段时间的生长，往往经过8-10年的时间长到1-2cm以上的时候，其顶端就会发现一些细胞的变异，然后乃至发生了腺瘤性的息肉的癌变，最后变成腺癌。因此也就是说，我们建议正常人是在50岁以上常规做肠镜检查，及早发现这些腺瘤性息肉，给予切除,就避免以后变成癌的几率。
3.现有技术中，在对肠癌类肿瘤的快速培养对肠癌类肿瘤的研究具有较高的价值，因此亟需一种肠癌类器官的新型高速培养方法。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于提供一种肠癌类器官的新型高速培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种肠癌类器官的新型高速培养方法，所述肠癌类器官的新型高速培养方法步骤如下：
6.步骤一：培养前准备，15ml无菌离心管、1.5ml离心管、24孔细胞培养板、移液器、移液管、无菌枪头等表面消毒后放入超净工作台中紫外照射30min，提前30min从4℃冰箱取出肠癌类器官培养基平衡至室温，提前1h从-20℃冰箱取出所需体积的基质胶冰上融化；
7.步骤二：肠癌类器官培养，将获取的肠癌原代细胞悬液计数，根据计算好的体积吸取细胞悬液加入预冷的1.5ml离心管中，补齐预冷的肠癌类器官培养基至所需体积；
8.步骤三：将预冷后的细胞悬液加入等体积的基质胶中轻轻混匀(全程冰上操作)，避免气泡，使肠癌原代细胞终浓度为5
×
105个细胞/量升。然后将细胞与基质胶的混合液按照50ul/孔呈半球形点胶干24孔板；
9.步骤四：将培养板放入5％co237℃培养箱中至少30min，待基质胶完全凝固。沿孔壁每孔缓慢加入500μl预先恢复至室温的类器官培养基，放置5％co2、37℃培养箱培养。
10.作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤四中，3天后镜下观察类器官形成情况粒径大于30～50μm即认为类器官已经形成，每5天更换一次培养基进行培养，持续观察类器官大小，镜下观察大部分类器官大小均大于30～50μm且大小不再增大即可收集类器官。
11.作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤四对器官培养过后，弃培养基，每孔加入200μl基质胶解离试剂，室温放置1min，轻轻吹打混匀，收集至15ml离心管中，50rpm恒温震荡解离10-20min，解离之后1500rpm离心3min，轻吸去上清，待用。
12.作为本发明的一种优选技术方案，所述培养肠癌类器官中，在使用前需平衡至室
温。
13.作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤一种，样本需为肿瘤组织，且肿瘤细胞比例越高(》50％)，类器官培养成功率越高，使用产品时应注意无菌操作，避免污染。
14.作为本发明的一种优选技术方案，所述不宜将其过夜放置于室温或较高的温度环境中，肠癌类器官培养过程要轻柔，避免基质胶凝固后散胶。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明一种肠癌类器官的新型高速培养方法，含有必需和非必需的氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、生长因子、微量矿物质等，该培养基的可以提供一个最佳人源肠癌类器官体外培养环境，选择性地快速的促进体外人源肠癌类器官的生长而且培养成功率高，能够保持肿瘤特征，药敏结果也与临床数据接近。
具体实施方式
16.对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
17.本发明提供了一种肠癌类器官的新型高速培养方法，所述肠癌类器官的新型高速培养方法步骤如下：
18.步骤一：培养前准备，15ml无菌离心管、1.5ml离心管、24孔细胞培养板、移液器、移液管、无菌枪头等表面消毒后放入超净工作台中紫外照射30min，提前30min从4℃冰箱取出肠癌类器官培养基平衡至室温，提前1h从-20℃冰箱取出所需体积的基质胶冰上融化；
19.步骤二：肠癌类器官培养，将获取的肠癌原代细胞悬液计数，根据计算好的体积吸取细胞悬液加入预冷的1.5ml离心管中，补齐预冷的肠癌类器官培养基至所需体积；
20.步骤三：将预冷后的细胞悬液加入等体积的基质胶中轻轻混匀(全程冰上操作)，避免气泡，使肠癌原代细胞终浓度为5
×
105个细胞/量升。然后将细胞与基质胶的混合液按照50ul/孔呈半球形点胶干24孔板；
21.步骤四：将培养板放入5％co237℃培养箱中至少30min，待基质胶完全凝固。沿孔壁每孔缓慢加入500μl预先恢复至室温的类器官培养基，放置5％co2、37℃培养箱培养。
22.其中，所述步骤四中，3天后镜下观察类器官形成情况粒径大于30～50μm即认为类器官已经形成，每5天更换一次培养基进行培养，持续观察类器官大小，镜下观察大部分类器官大小均大于30～50μm且大小不再增大即可收集类器官。
23.因此，所述步骤四对器官培养过后，弃培养基，每孔加入200μl基质胶解离试剂，室温放置1min，轻轻吹打混匀，收集至15ml离心管中，50rpm恒温震荡解离10-20min，解离之后1500rpm离心3min，轻吸去上清，待用。
24.进一步地，所述培养肠癌类器官中，在使用前需平衡至室温。
25.更进一步地，所述步骤一种，样本需为肿瘤组织，且肿瘤细胞比例越高(》50％)，类器官培养成功率越高，使用产品时应注意无菌操作，避免污染。
26.优选地，所述不宜将其过夜放置于室温或较高的温度环境中，肠癌类器官培养过程要轻柔，避免基质胶凝固后散胶。
27.进一步地，肠癌类器官传代：
28.(1)收集的类器官，加入适量的消化酶，37℃，200rpm消化(具体时间根据类器官大小和数量决定，以肉眼可见颗粒明显减小一半为准，可中间取消化的类器官显微镜观察，类器官消化至3-10个细胞集合体最佳)。
29.(2)消化完全后1500rpm离心3min，弃上清，使用清洗液重悬后1500rpm离心3min；加入预冷的肠癌类器官培养基进行重悬，计数，按照培养步骤操作继续培养
30.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
技术特征：
1.一种肠癌类器官的新型高速培养方法，其特征在于，所述肠癌类器官的新型高速培养方法步骤如下：步骤一：培养前准备，15ml无菌离心管、1.5ml离心管、24孔细胞培养板、移液器、移液管、无菌枪头等表面消毒后放入超净工作台中紫外照射30min，提前30min从4℃冰箱取出肠癌类器官培养基平衡至室温，提前1h从-20℃冰箱取出所需体积的基质胶冰上融化；步骤二：肠癌类器官培养，将获取的肠癌原代细胞悬液计数，根据计算好的体积吸取细胞悬液加入预冷的1.5ml离心管中，补齐预冷的肠癌类器官培养基至所需体积；步骤三：将预冷后的细胞悬液加入等体积的基质胶中轻轻混匀(全程冰上操作)，避免气泡，使肠癌原代细胞终浓度为5
×
105个细胞/量升。然后将细胞与基质胶的混合液按照50ul/孔呈半球形点胶干24孔板；步骤四：将培养板放入5％co237℃培养箱中至少30min，待基质胶完全凝固。沿孔壁每孔缓慢加入500μl预先恢复至室温的类器官培养基，放置5％co2、37℃培养箱培养。2.根据权利要求1所述的一种肠癌类器官的新型高速培养方法，其特征在于：所述步骤四中，3天后镜下观察类器官形成情况粒径大于30～50μm即认为类器官已经形成，每5天更换一次培养基进行培养，持续观察类器官大小，镜下观察大部分类器官大小均大于30～50μm且大小不再增大即可收集类器官。3.根据权利要求2所述的一种肠癌类器官的新型高速培养方法，其特征在于：所述步骤四对器官培养过后，弃培养基，每孔加入200μl基质胶解离试剂，室温放置1min，轻轻吹打混匀，收集至15ml离心管中，50rpm恒温震荡解离10-20min，解离之后1500rpm离心3min，轻吸去上清，待用。4.根据权利要求1所述的一种肠癌类器官的新型高速培养方法，其特征在于：所述培养肠癌类器官中，在使用前需平衡至室温。5.根据权利要求1所述的一种肠癌类器官的新型高速培养方法，其特征在于：所述步骤一种，样本需为肿瘤组织，且肿瘤细胞比例越高(>50％)，类器官培养成功率越高，使用产品时应注意无菌操作，避免污染。6.根据权利要求1所述的一种肠癌类器官的新型高速培养方法，其特征在于：所述不宜将其过夜放置于室温或较高的温度环境中，肠癌类器官培养过程要轻柔，避免基质胶凝固后散胶。
技术总结
本发明公开了一种肠癌类器官的新型高速培养方法，所述肠癌类器官的新型高速培养方法步骤如下：步骤一：培养前准备；步骤二：肠癌类器官培养，步骤三：将预冷后的细胞悬液加入等体积的基质胶中轻轻混匀避免气泡，使肠癌原代细胞终浓度为5
技术研发人员：孙涛
受保护的技术使用者：零壹人工智能科技研究院（南京）有限公司
技术研发日：2022.11.23
技术公布日：2023/3/21