一种吡唑并[1,5-a]吡啶衍生物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及一种新型吡唑并[1,5-a]吡啶衍生物及其制备方法和应用。具体地，涉及一种具有抑制激酶高表达的肿瘤株或者相应激酶突变的肿瘤细胞株生长的新型吡唑并[1,5-a]吡啶衍生物及其制备方法。特别地，这些化合物可作为治疗增生性病症、及其它与trk、ret、fghr、pdgfr、vegfr等任何一种或者多种激酶表达异常有关的疾病的药物。此外，本发明涉及含有这些化合物的药物和这些化合物在制备药物中的应用。


背景技术：

[0002]
肿瘤是威胁人类健康的重大疾病之一，社会对肿瘤的治疗存在重大需求。随着肿瘤分子生物学和肿瘤药理学的发展，肿瘤的化疗及免疫疗法也取得了长足的发展。并且在肿瘤的各种治疗中，肿瘤的小分子靶向药物治疗正发挥越来越重要的作用。
[0003]
[ntrk/trk(tropomyosin receptor kinase)]为神经营养因子酪氨酸激酶受体。trk家族主要包括3个成员，ntrk1/trka，ntrk2/trkb和ntrk3/trkc。完整的trk激酶包括胞外区、跨膜区和胞内区三个部分。trk激酶的胞外区与相应的配体结合之后，能够引起激酶构型变化，形成二聚体。trk激酶的胞内区发生自体磷酸化从而激活自身的激酶活性，进而进一步激活下游的信号转导通路(如mapk，akt，pkc等)，产生相应的生物学功能；其中ngf(神经生长因子)结合trka，bdnf(衍生的神经营养因子)结合trkb，以及nt3(神经营养因子3)结合trkc。
[0004]
大量的研究表明trk信号转导通路的活化与肿瘤的发生发展也有很强的相关性，在神经细胞瘤、前列腺癌、乳腺癌等中都发现了活化的trk信号蛋白。近几年来多种trk融合蛋白的发现，更显示了其促进肿瘤发生的生物学功能(sharan k bagal,mark andrews,bruce m.bechle,jianwei bian,james bilsland,david c blakemore,john braganza,peter j.bungay,matthew s.corbett,ciar
á
n n cronin,jingrong jean cui,rebecca dias,neil j flanagan,samantha e greasley,rachel grimley,kim james,eric johnson,linda kitching,michelle l kraus,indrawan mcalpine,asako nagata,sacha ninkovic,kiyoyuki omoto,stephanie scales,sarah e.skerratt,jianmin sun,michelle tran-dub
é
,gareth j.waldron,fen wang,and joseph s warmus.discovery of potent,selective and peripherally restricted pan-trk kinase inhibitors for the treatment of pain.j.med.chem.,just accepted manuscript
·
doi:10.1021/acs.jmedchem.8b00633
·
publication date(web):26jun 2018)。
[0005]
近几年来，trk融合蛋白已经成为一个有效的抗癌靶点和研究热点，例如以larotrectinib(1)lisa jarvis.bayer,loxo to develop trk inhibitors.c&en,20november 2017,11；2)(wo2010048314)、entrectinib(wo2009013126a1)等为代表的trk激酶抑制剂已经进入了临床应用。更多的trk激酶抑制剂已经处于临床的各种不同阶段。wo2012116217、wo2010033941、jp2018044010 a、mx2017007748 a、us2017057948a1等公开了具有不同母核的trk激酶抑制剂。鉴于trk生理学功能的重要性，对活性更强、适应基因融
合范围更广的trk抑制剂吸引了广泛的兴趣。特别是对那些不仅可以抑制trka、b和c，而且可以抑制它们的突变形式(例如g595r、g667c、a608d、f589l、g623r)的trk抑制剂，仍然没有满足社会的的需要。
[0006][0007]
另一方面，转染重排(ret)是一种神经生长因子受体酪氨酸激酶；异常ret激酶活性与众多肿瘤有关。因此，ret也是受到高度重视的一个抗肿瘤靶点。
[0008]
ret是一种神经元生长因子受体络氨酸激酶。ret激酶敲除的老鼠缺乏肠内神经元并具有其他神经系统异常，这说明功能性ret激酶蛋白产物是发展所需要的。对先天性巨结肠症病人种群的研究表明，其与家族性和偶发性的功能ret突变频率较高。异常ret激酶活性与多样内分泌腺瘤(men2a和2b)、家族性髓样甲状腺瘤(fmtc)，甲状腺乳头状癌(ptc)和先天性巨结肠症(hscr)(mariagraziaborrello,elenaardini,lauradlocati,angelagreco,lisalicitra&marcoapierotti(2013).retinhibition:implicationsincancertherapy.expertopinionontherapeutictargets,17:4,403-419)相关。men2a是一种癌症综合征，由ret细胞外富半胱氨酸区域的突变而导致二硫键形成的二聚，从而致使络氨酸激酶的活性处于连续激活下(samuela.wells,jr,furiopacini,bruceg.robinson,andmassimosantoro.multipleendocrineneoplasiatype2andfamilialmedullarythyroidcarcinoma:anupdate.jclinendocrinolmetab98:3149
–
3164,2013)。具有这种突变的个体可能会形成髓样甲状腺瘤(mtc)、甲状腺增生和嗜铬细胞瘤。men2b和men2a类似，但没有甲状腺增生，也导致嘴唇、舌头和肠道各种粘膜腱鞘囊肿。ret被认为在染色体重拍过程中介入了ptc的肿瘤引发。ptc包括了80％的甲状腺瘤(viglietto，g.etal.，oncogene，1995，11：1207)。
[0009]
这些事实都说明治疗ret持续激活相关的肿瘤的一个理想治疗手段。ret抑制剂的研究受到广泛重视，也取得了较快的发展。其中，以pralsetinib(wo2017011776a1arrayloxo292)、selpercatinib(wo2017079140a1blu667)为代表的ret抑制剂先后获得fda批准上市，用以不分肿瘤治疗各种相关融合肿瘤并且取得了成功。从而又鼓舞着其它各种不同的开发尝试。((1)lucillelopez-delisle,c
é
cilepierre-eug
è
ne,carolinelouis-brennetot,didiersurdez,virginieraynal,sylvainbaulande,valentinaboeva,sandrinegrosset
ê
te-lalami,val
é
riecombaret,michelpeuchmaur6,olivierdelattre,isabellejanoueix-lerosey.activatedalksignalsthroughtheerk
–
etv5
–
ret pathway to drive neuroblastoma oncogenesis.oncogene(2018)37:1417
–
1429.(2)wo 2014/141187a1.ret kinase inhibitors may treat cancer and gastrointestinal disorders.(3)minsoo song.progress in discovery of kif5b-ret kinase inhibitors for the treatment of non-small-cell lung cancer.miniperspective.j.med.chem.2015,58,3672-3681.)
[0010][0011]
如前所述，以trk和ret为代表的激酶抑制剂的研究开发，在治疗融合肿瘤方面，分别取得了较大的成功，为广大患者带来福音。但是，分别以trk和ret为核心而与其它基因发生融合的肿瘤，所占的比例仍然较小(alexander drilon,zishuo i.hu,gillianne g.y.lai&daniel s.w.tan targeting ret-driven cancers:lessons from evolving preclinical and clinical landscapes.nature reviews clinical oncology volume15,2018,151
–
167)。显然，如果能够有效抑制trk、ret，甚至同时能够抑制fghr、pdgfr、vegfr等中的一种或者多种激酶，将是一种有效的选择。另一方面，几乎所有的激酶靶点，耐药性始终是主要存在问题。因此，本领域对更多的多靶点激酶抑制剂，仍然有巨大的社会需求。


技术实现要素：

[0012]
本发明的目的在于公开一种新型吡唑并[1,5-a]吡啶衍生物及其制备方法和应用。这类化合物可以用于肿瘤、内分泌紊乱、免疫系统疾病、遗传病和神经退化性疾病方面的作用。
[0013]
为了实现上述目的，发明人进行了长期的努力研究，发现下述通式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐具有优异的抑制激酶活性、特别是抑制trk、ret、fghr、pdgfr、vegfr等任何一种或者多种激酶活性的效果，可作为治疗增生性病症及其它与各种激酶表达异常有关的疾病的药物。
[0014]
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
[0015]
一种吡唑并[1,5-a]吡啶衍生物，为由通式(i)表示的化合物，及其光学异构体或其药学上可接受的盐：
[0016][0017]
在上述通式(i)中，
[0018]
r1选自：氢原子、羧基、硝基、氨基、氰基、酰基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤素、同位素、卤代烯基、杂烷基、芳基烷基、环烷基、芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、杂环烯基、烷氧基烷基、烯氧基、炔氧基、烷基氨基、氨基烷基、烷基氨基羰基、磺酰基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、或氨基磺酰基；上述基团中的任一基团独立地可以被一个或多个取代基取代，这些取代基包括但不限于卤素、同位素、氨基、羧基、苯基、苄基、苯基氧基、＝o、-cf3、卤代烷基、烷基、杂烷基、烯基、炔基、羟基、羟烷基、烷氧基、和烷氧基烷基；
[0019]
l1选自：共价键、-ch
2-ch
2-、-ch＝ch-、-c≡c-、-nh-、、上述基团中的任一基团独立地可以被一个或多个取代基取代，这些取代基包括但不限于卤素、同位素、＝o、-cf3、烷基、卤代烷基、羟基、烷氧基、和烷氧基烷基；
[0020]
l2选自：共价键、亚烷基、亚杂烷基、羰基、-c(o)-nh-，-烷基-c(o)-nh-、-烷基-nh-c(o)-，-烷基-o-；上述基团中的任一基团各自独立地可以被一个或多个取代基取代，这些取代基包括氢原子、同位素、烷基、烷氧基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基；
[0021]
l3选自：共价键、亚烷基、亚杂烷基、羰基、-o-、-nh-、-c(o)-nh-、-nh-c(o)-、-烷基-c(o)-nh-、-烷基-nh-c(o)-，-烷基-nh-，-烷基-o-；上述基团中的任一基团各自独立地可以被一个或多个取代基取代，这些取代基包括氢原子、同位素、烷基、烷氧基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基；
[0022]
r2选自：氢原子、烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、烷醚基、杂烷醚基、芳基烷醚基、环烷醚基、芳醚基、杂芳醚基、杂芳基烷醚基、杂环烷醚基、羧基、羧基烷基氨基羰基、环烷基氨基羰基、杂芳基氨基羰基、杂芳基氨基羰基；上述基团中的任一基团各自独立地可不被取代或者可以被一个或多个取代基取代，这些取代基包括但不限于卤素、同位素、氨基、羧基、苯基、苄基、苯基氧基、＝o、-cf3、卤代烷基、烷基、烯基、炔基、羟基、羟烷基、烷氧基、烷氧基烷基、杂烷基、芳基烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、杂环烯基、烷氧基烷基、烯氧基、炔氧基、烷基氨基、氨基烷基、烷基氨基羰基、磺酰基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、或氨基磺酰基。
[0023]
r3选自：氢原子、烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂芳
基烷基、杂环烷基、烷基醚基、杂烷基醚基、芳基烷醚基、环烷醚基、芳醚基、杂芳醚基、杂芳基烷醚基、杂环烷醚基、烷基氨基、杂烷氨基、芳基烷氨基、环烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、杂芳基烷基氨基、杂环烷基氨基、羧基、羧基烷基氨基羰基、环烷基氨基羰基、杂芳基氨基羰基、杂芳基氨基羰基；上述基团中的任一基团各自独立地可不被取代或者可以被一个或多个取代基取代，这些取代基包括但不限于卤素、同位素、氨基、羧基、苯基、苄基、苯基氧基、＝o、-cf3、卤代烷基、烷基、烯基、炔基、羟基、羟烷基、烷氧基、烷氧基烷基、杂烷基、芳基烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、杂环烯基、烷氧基烷基、烯氧基、炔氧基、烷基氨基、氨基烷基、烷基氨基羰基、磺酰基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、或氨基磺酰基。
[0024]
在某些实施方案中，通式(i)中，r1为氢原子、羧基、硝基、氨基、氰基、酰基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤素、同位素、卤代烯基、杂烷基、杂烷基、芳基、杂芳基；在以上基团中，各自可不被取代或被一个或多个取代基取代，这些取代基包括：卤素、同位素、＝o、-cf3、烷基、链烯基、链炔基、羧基、羟基、羟烷基、烷氧基、烷氧烷基、-c≡n。
[0025]
在另外一些实施方案中，通式(i)中，l3选自o-ch
2-r4；其中r4选自
[0026]
在某些实施方案中，通式(i)中，r3选自c1-c5烷基、杂环基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基；上述基团中的任一基团各自独立地可不被取代或者可以被一个或多个取代基取代，这些取代基包括但不限于卤素、同位素、氨基、烷基。
[0027]
在另外某些实施方案中，通式(i)中，l1选自：-ch
2-ch
2-、-ch＝ch-、-c≡c-。
[0028]
在某些实施方案中，通式(i)中，l2选自：亚烷基、亚杂烷基、羰基、-c(o)-nh-、-烷基-c(o)-nh-、-烷基-nh-c(o)-。
[0029]
在另外某些实施方案中，通式(i)中，l2选自：吡啶、取代吡啶、嘧啶、取代嘧啶、取代苯环、-co-nh-、-c(o)-、-ch
2-nh-、、-c(ch2)-nh-、-co-n(oh)-；所述烷基为c1-c5直链或者支链烷基；所述取代吡啶的取代基为c1-c5直链或者支链烷基；所述取代嘧啶的取代基为c1-c5直链或者支链烷基、氨基。
oh、
[0033][0034]
r5选自氢、
[0035]
r6选自氢、苯环、取代苯环、嘧啶；
[0036]
所述取代苯环含有1-3个取代基，取代苯环的取代基选自氨基、c1-c5烷基、卤素、三氟甲基、三氯甲基、三溴甲基、三氟乙基、三氟丙基、甲醚基、乙醚基、丙醚基、三氟甲醚基、三氟乙醚基、三氟丙醚基、-c≡ch、-cn；
[0037]
r7选自c1-c8烷基；
[0038]
所述取代嘧啶含有1-3个取代基，取代嘧啶的取代基选自氨基、c1-c5烷基、卤素；
[0039]
所述取代吡啶含有1-3个取代基，取代吡啶的取代基选自c1-c8烷基、二氟苯环、甲醚基；
[0040]
r8选自氢、取代吡啶、c1-c8烷基。
[0041]
在某些实施方案中，所述取代苯环选自甲苯、乙苯、对氟甲苯。
[0042]
在某些实施方案中，所述吡唑并[1,5-a]吡啶衍生物还可以是由通式(i)表示的化合物，及其光学异构体或其药学上可接受的盐：
[0043]
13.
[0044][0045]
在上述通式(i)中，
[0046]
r1选自：氢原子、羧基、硝基、氨基、氰基、酰基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤素、同位素、卤代烯基、杂烷基、芳基烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、杂环烯基、烷氧基烷基、烯氧基、炔氧基、烷基氨基、氨基烷基、烷基氨基羰基、磺酰基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、或氨基磺酰基；上述基团中的任一基团独立地可以被一个或多个取代基取代，这些取代基包括但不限于卤素、同位素、氨基、羧基、苯基、苄基、苯基氧基、＝o、-cf3、卤代烷基、烷基、杂烷基、烯基、炔基、羟基、羟烷基、烷氧基、和烷氧基烷基；
[0047]
l3选自：共价键、亚烷基、亚杂烷基、羰基、o、nh、co-nh，nh-co、烷基-co-nh、烷基-nh-co，烷基-nh，烷基-o；上述基团中的任一基团各自独立地可以被一个或多个取代基取代，这些取代基包括氢原子、烷基；
[0048]
r3选自：氢原子、烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、烷基醚基、杂烷基醚基、芳基烷醚基、环烷醚基、芳醚基、杂芳醚基、杂芳基烷醚基、杂环烷醚基、烷基氨基、杂烷氨基、芳基烷氨基、环烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、杂芳基烷基氨基、杂环烷基氨基、羧基、羧基烷基氨基羰基、环烷基氨基羰基、杂芳基氨基羰基、杂芳基氨基羰基；上述基团中的任一基团各自独立地可不被取代或者可以被一个或多个取代基取代，这些取代基包括但不限于卤素、同位素、氨基、羧基、苯基、苄基、苯基氧基、＝o、-cf3、卤代烷基、烷基、烯基、炔基、羟基、羟烷基、烷氧基、烷氧基烷基、杂烷基、芳基烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、杂环烯基、烷氧基烷基、烯氧基、炔氧基、烷基氨基、氨基烷基、烷基氨基羰基、磺酰基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、或氨基磺酰基；
[0049]
其中，l
1-l
2-r2选自：
[0050][0051]
其中，r9,r
10
,r
11
,和r
12
独立选自：氢原子、烷基、杂烷基、烯基、炔基、芳基烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、烷基醚基、杂烷基醚基、芳基烷醚基、环烷醚基、
芳醚基、杂芳醚基、杂芳基烷醚基、杂环烷醚基、烷基氨基、杂烷氨基、芳基烷氨基、环烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、杂芳基烷基氨基、杂环烷基氨基、羧基、羧基烷基氨基羰基、环烷基氨基羰基、杂芳基氨基羰基、杂芳基氨基羰基；上述基团中的任一基团各自独立地可不被取代或者可以被一个或多个取代基取代，这些取代基包括但不限于卤素、同位素、氨基、羧基、苯基、苄基、苯基氧基、＝o、-cf3、卤代烷基、烷基、烯基、炔基、羟基、羟烷基、烷氧基、烷氧基烷基、杂烷基、芳基烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、杂环烯基、烷氧基烷基、烯氧基、炔氧基、烷基氨基、氨基烷基、烷基氨基羰基、磺酰基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、或氨基磺酰基。
[0052]
在某些实施方案中，通式(i)中，其结构可以选自以下结构之一，或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药：
[0053]
[0054]
[0055]
[0056]
[0057]
[0058]
[0059]
[0060][0061]
本发明还公开了上述的吡唑并[1,5-a]吡啶衍生物的制备方法，l2＝co-nh，制备方法包括：
[0062]
s1、选择i作为原料，在催化剂的作用下脱去甲基，得到化合物ii；
[0063]
s2、在催化下，化合物ii与硼化合物iii作用得到iv；
[0064]
s3、在n-苯基双(三氟甲磺酰亚胺)的作用下，化合物iv即转化为化合物v；
[0065]
s4、化合物vi与化合物vii经过缩合所得的化合物viii；
[0066]
s5、化合物viii与化合物v反应，即得到化合物ix，即同通式(i)所示的目标化合物；
[0067][0068]
在某些实施例中，化合物i-1为：化合物i-1的合成方法包括：
[0069]
a、x作为原料，经过酰化、氨化，得到xiv；
[0070]
b、在酸作用下，xiv环合得到化合物xvi；
[0071]
c、在化合物xvi上引入甲酰基，后者经羟胺化转为晴基，再在催化剂的作用下脱去甲基，得到化合物i-1；
[0072][0073]
在某些实施例中，l1＝ch＝ch或-c≡c-，l
2-r2为取代苯基，所述的吡唑并[1,5-a]吡啶衍生物的制备方法包括：
[0074]
1)碘代化合物xix作为原料，在催化剂的作用下与xx反应，得到化合物xxi；
[0075]
2)化合物xxi在碱性甲醇溶液中反应得到xxii；
[0076]
3)xxii与化合物v反应，得到化合物xxiii；
[0077][0078]
本发明还包括一种药学组合物，其含有上述的通式(i)所示的化合物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或前药：
[0079]
本发明还包括上述的通式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐与其它一种或多种药物的联合使用。
[0080]
本发明还包括上述的通式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗由细胞增殖和/或血管新生的破坏所导致、或与该破坏相关联或相伴随的病症的药物中的用途。
[0081]
本发明还包括上述的通式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐或者如上所述的药物组合物用于抑制激酶的活性的用途。
[0082]
在某些实施方案中，所述抑制激酶的活性是抑制trk或和ret、raf、fghr、pdgfr、vegfr各种激酶中的一种或者多种的活性。
[0083]
在某些实施方案中，所述抑制激酶的活性是抑制trk活性。
[0084]
在某些实施方案中，所述抑制激酶的活性是抑制ret活性。
[0085]
本发明还包括一种用于治疗患者的由细胞增殖和/或血管新生的破坏所导致、或与该破坏相关联或相伴随的病症的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的上述的通式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐。
[0086]
本发明还包括一种治疗可通过抑制患者激酶而加以治疗的病症的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的上述的通式(i)所示的化合物或其药学上可接受的盐。
[0087]
在某些实施方案中，所述病症选自：增殖性疾病，例如非小细胞肺癌、肾细胞癌、胃癌、肝细胞癌、结肠直肠癌、髓样甲状腺癌、滤泡性甲状腺癌、未分化甲状腺癌、乳头状甲状腺癌、脑瘤、腹膜腔癌、实体瘤、其它肺癌、肾细胞癌、胃癌、头颈癌、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、von hipple-lindau综合征和肾肿瘤、乳腺癌、输卵管癌、卵巢癌、过渡型细胞癌、前列腺癌、食道和食管胃连接处的癌症、胆道癌和腺癌、及带有增加的trk、ret、fghr、pdgfr、vegfr等任何一种或者多种激酶活性的任何恶性肿瘤；神经变性疾病，包括：亨廷顿病、聚谷氨酰胺病、帕金森病、阿尔茨海默病、癫痫发作、纹状体黑质变性、进行性核上性麻痹、扭转张力不全、痉挛性斜颈和运动障碍、家族性震颤、抽动秽语综合症、弥漫性路易体疾病、皮克病、颅内出血、原发性侧索硬化症、脊髓性肌肉萎缩症、肌萎缩侧索硬化症、肥大性间质性多神经病、视网膜色素变性、遗传性视神经萎缩、遗传性痉挛性截瘫、进行性共济失调症和shy-drager综合征；代谢性疾病，包括：2-型糖尿病；眼部退化疾病，包括：青光眼、老年黄斑变性、虹膜红变性青光眼：涉及血管新生的疾病，包括：癌症、牛皮癣；心理病症，包括：双相性精神障碍、精神分裂症、躁狂症、抑郁和痴呆；心血管疾病包括：心力衰竭、再狭窄和动脉硬
化；纤维化疾病，包括：肝纤维化、囊性纤维病和血管纤维痛：感染性疾病，包括：真菌感染。例如：白色念珠菌，细菌感染、病毒性感染。例如：单纯疱疹，原虫感染，例如：疟疾、利什曼原虫感染、布氏锥虫感染、弓形体病和球虫病，以及造血性病症，包括：海洋性贫血、贫血和镰状细胞性贫血。
[0088]
在某些实施方案中，在上述的方法中，所述患者正在接受手术或放射性治疗，所述化合物与所述手术或放射性治疗伴随地、或在手术或放射性治疗之前、或在手术或放射性治疗之后施用于所述患者。
附图说明
[0089]
图1为本发明化合物在tt模型的体内抗肿瘤活性。
具体实施方式
[0090]
对于本发明的通式(i)所示的化合物的各基团，如下述所定义。
[0091]“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
[0092]“＝o”是指氧代基。
[0093]“cf
3”是指三氟甲基。
[0094]“co-nh”是
“‑
酰胺
‑”
。
[0095]“nh-co”是“氨酰基”。
[0096]“羰基”是指
[0097]“烷基”当作一基团或一基团的部分时是指直链或带有支链的脂肪烃基团，其中没有或者有一个或多个(优选1、2或3个)碳原子被氧、氮、磷、硼、硒、硅或硫原子(优选氧、硫或氮)所代替。
[0098]“烷基”优选为：c1-c14烷基，更优选为c1-c10烷基；最优选为c1-c6烷基，除非另有指明。c1-c6烷基的实例包括，但不限于：甲基、乙基、正丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、特丁基、己基等。
[0099]“烷基”最优先选择为c1-c6，除非另有指明。直链或和带有支链的c1-c6烷基的实例包括，但不限于：甲基、乙基、正丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、特丁基、己基等。
[0100]“环烷基”是指饱和或部分饱和的单环、稠环或螺环的碳环。优选为以3-9个碳原子组成的环。实例包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。
[0101]“杂烷基”是指直链或支链的烷基中的一个或多个(优选1、2或3个)碳原子被氧、氮、磷、硼、硒、硅或硫原子(优选氧、硫或氮)代替而形成的基团。优选原子数为2-14的杂烷基，更优选原子数为2-8，特别优选原子数为2-6。杂烷基包括但不限于：醚类、硫醚类、烷基酯类，烷基仲胺类、烷基叔胺类、烷基亚磺酸类、腈、异腈、氰酸酯、硫氰酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯和烷基腈等的基团，具体可以列举例如：甲氧基、三氟甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基、甲氧基甲基、乙氧基甲基、甲氧基乙基、甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、异丙基乙基氨基、甲基-氨基甲基、乙基氨基甲基、二-异丙基氨基乙基、烯醇醚、二甲基氨基甲基、二甲基氨基乙基、乙酰基、丙酰基、丁酰氧基、乙酰氧基、甲氧基羰基、乙氧基-羰基、n-乙基-n-甲基氨基甲酰基或n-甲基氨基甲酰基。
[0102]“杂环烷基”是指上文定义的“环烷基”中的一个或多个(优选1、2或3个)碳原子被氧、氮、磷、硼、硒、硅或硫原子(优选氧、硫或氮)代替而形成的基团。其中，杂环烷基和烷基部分见本文有关定义。优选含有1-3个杂原子。优选的环为3-14元环(即，3-14元杂环烷基)，更优选的环为4-7元环(即，4-7元杂环烷基)。杂环烷基包括但不限于：吡咯烷基、二氢吡咯基、四氢吡咯基、二氢吡唑基、哌啶基、吗啉基、四氢呋喃基、四氢硫代呋喃基、四氢吡喃基、氧杂环丙基、氮杂环丙基或2-吡唑啉基，以及内酰胺、内酯、环状亚胺和环状酸酐等。杂环烷基可被一个或多个取代基取代。
[0103]“杂环烷基烷基”是指：(杂环烷基-烷基)-的基团。其中，杂环烷基和烷基部分见本文有关定义。杂环烷基烷基基团包括但不限于：(2-四氢呋喃基)甲基、(2-四氢硫代呋喃基)甲基等。
[0104]“烷基氨基”包括单烷基氨基和二烷基氨基两种，除非另有指明。“单烷基氨基”是指：(烷基-nh)-的基团；“二烷基氨基”是指：((烷基)2n)-的基团。其中的烷基见本文有关定义。该烷基氨基优选为c1-c6烷基氨基。应予说明，“c1-c6烷基氨基”是指被“c1-c6烷基”取代了的氨基，其实例包括，但不限于：甲氨基、乙氨基、异丙氨基、n,n-(二乙基)氨基等。
[0105]“杂烷氨基”是指：单-杂烷基氨基和二-杂烷基氨基两种，除非另有说明。单-杂烷基氨基是指：(杂烷基-)nh-的基团；二-杂烷基氨基是指(杂烷基)2n-的基团。其中的“杂烷基”部分的定义见本文相关部分。
[0106]“氨基烷基”是指：(氨基-烷基)-的基团。其中的“烷基”部分见本文有关定义。该氨基烷基优选为氨基c1-c6烷基。应予说明，“氨基-c1-c6烷基”是指被“氨基”取代了的c1-c6烷基，其实例包括但不限于：氨基乙基、1-氨基丙基、2-氨基丙基等。
[0107]“芳基氨基”包括单-芳基氨基和二-芳基氨基两种，除非另有说明。单-芳基氨基是指：(芳基-)nh-的基团；二-芳基氨基是指(芳基)2n-的基团。其中的“芳基”部分的定义见本文相关部分。
[0108]“酰基”包括(烷基-co)-的基团和(芳基-co)-的基团，除非另有说明。其中的“烷基”或“芳基”部分均见本文中的有关定义。酰基的实例包括，但不限于：乙酰基、丙酰基、异丁酰基、苯甲酰基等。
[0109]“酰胺基”包括(烷基-conh)-的基团和(芳基-conh)-的基团，除非另有说明。其中的“烷基”或“芳基”部分均见本文中的有关定义。酰胺基的实例包括，但不限于：乙酰胺基、丙酰胺基、丁酰胺基、异丁酰胺基、苯甲酰胺基等。
[0110]“烯基”作为一基团或一基团的一部分时是指至少含有一个碳-碳双键的脂肪烃基团，可为直链或支链。优选为c2-c14烯基，更优选为c2-c12烯基，最优选为c2-c6烯基。该基团可在其主链中含有多个双键且其构象可各自为e或z。烯基基团的例子包括，但不限于：乙烯基、丙烯基等。另外，本发明的“链烯基”是指上述定义的“烯基”为链状时的基团。
[0111]“炔基”作为一基团或一基团的一部分时是指至少含有一个碳-碳三键的脂肪烃基团，可为直链或支链。优选为c2-c14炔基，更优选为c2-c12炔基，最优选为c2-c6炔基。所述炔基的例子包括，但不限于：乙炔基、丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基、丁-1-炔-1-基、丁-3-炔-1-基、1-甲基丙-2-炔-1-基、戊-1-炔-1-基、戊-4-炔-1-基、己-1-炔-1-基、己-5-炔-1-基等。
[0112]“烷氧基”是指(烷基-o)-的基团。其中的“烷基”部分见本文有关定义。所述烷氧基
优选为c1-c8烷氧基，更优选为c1-c6烷氧基。所述烷氧基的实例包括，但不限于：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、1-甲基乙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、新戊氧基、1-甲基丁氧基、1-乙基丙氧基、正己氧基、异己氧基、3-甲基戊氧基、2-甲基戊氧基、1-甲基戊氧基、3,3-二甲基丁氧基、2,2-二甲基丁氧基、1,1-二甲基丁氧基、1,2-二甲基丁氧基、1,3-二甲基丁氧基、2,3-二甲基丁氧基、1-乙基丁氧基、2-乙基丁氧基等。另外，“烷氧基羰基”表示上述定义的“烷氧基”与羰基键合的基团，例如可举出甲氧基羰基、乙氧基羰基等。
[0113]“烯氧基”是指(烯基-o)-的基团。其中的“烯基”部分见本文有关定义。优选为c2-c6烯氧基。
[0114]“炔氧基”是指(炔基-o)-的基团。其中的“炔基”部分见本文有关定义。优选为c2-c6炔氧基。
[0115]“烷氧羰基”是指(烷基-o-c(o))-的基团。其中，烷基见本文有关定义。优先选择的烷基基团为c1-c6烷基。其实例包括但不限于：甲氧羰基、乙氧羰基等。
[0116]“烷基亚磺酰基”是指(烷基-s(o))-的基团。其中的“烷基”部分见本文有关定义。优选为c1-c6烷基亚磺酰基。烷基亚磺酰基的实例包括但不限于：甲基亚磺酰基、乙基亚磺酰基等。
[0117]“烷基磺酰基”是指(烷基-s(o)
2-o)-的基团。其中的“烷基”部分见本文有关定义。优选为c1-c6烷基磺酰基。应予说明，“c1-c6烷基磺酰基”是指被“c1-c6烷基”取代了的磺酰基，可以列举甲基磺酰基、乙基磺酰基、正丙基磺酰基、异丙基磺酰基、正丁基磺酰基、异丁基磺酰基、仲丁基磺酰基、叔丁基磺酰基、正戊基磺酰基、异戊基磺酰基、新戊基磺酰基、叔戊基磺酰基等的基团。
[0118]“烷基氨基羰基”是指烷基氨基-羰基基团。其中的“烷基氨基”部分见本文有关定义。
[0119]“环烷基烷基”是指环烷基-烷基基团。其中，环烷基和烷基部分见本文有关定义。单环烷基烷基包括但不限于：环丙基甲基，环戊基甲基，环己基甲基、环庚基甲基等。
[0120]“杂环烯基”是指上述定义的“杂环烷基”中至少含有一个双键的基团。
[0121]“芳基”作为一基团或一基团的部分是指：(1)芳香性的单环或稠环的芳香族烃环基；优选为6-12元芳基(也表述为c6-c12芳基)，更优选6-10元芳基(也表述为c6-c10芳基)，其实例包括但不限于：苯基、萘基、蒽基和菲基；或(2)可以连接部分饱和的碳环、例如：苯基和c5-7环烷基或c5-7环烯基基团系互相稠合而形成一环状结构。实例包括但不限于：四氢萘基，茚基或氢茚基等。芳基基团可被一个或多个取代基取代。
[0122]“芳基烯基”是指：(芳基-烯基)-的基团。其中的“芳基”和“烯基”部分见本文有关定义。示例性的芳基烯基基团包括，但不限于：苯基丙烯基等。
[0123]“芳烷基”是指：(芳基-烷基)-的基团。其中，芳基和烷基部分见本文有关定义。示例性的芳烷基基团包括，但不限于：苯甲基，苯乙基、1-萘甲基等。
[0124]“环烯基”是指非芳香性单环或多环环系，其至少含有一个碳-碳双键且每环优选具有5-10个碳原子。示例性的单环状环烯基环包括，但不限于：环戊烯，环己烯或环庚烯。环烯基团可被一个或多个取代基取代。
[0125]“杂芳基”是指单环的或稠合多环的芳香杂环基，优选其是具有一个或多个(优选3
至14个、更优选5至10个、尤其优选5或6个)碳原子、和一个或多个(优选1、2、3或4个)氧、氮、磷或硫环原子(优选o、s或n)作为成环原子的芳族基团，优选该芳族基团为4-15元杂芳基，更优选为5-7元杂芳基。所述杂芳基的实例可以列举例如：呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、三唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚基、苯并咪唑基、吡啶基、咪唑基、3-苯基吡咯基、噻唑基-噁唑基、四唑基、异噁唑基、吲唑基、哒嗪基、喹啉基、嘌呤基、咔唑基、吖啶基、嘧啶基、2，3
’‑
联呋喃基和异喹啉基。
[0126]“杂芳基烷基”是指：(杂芳基-烷基)-的基团。其中，杂芳基和烷基部分见本文有关定义。示例性的杂芳基烷基基团包括，但不限于：2-呋喃甲基、3-呋喃甲基、2-吡啶甲基等。
[0127]“烷基醚基”是指：(烷基)-o-的基团。其中的“烷基”部分见本文有关定义。
[0128]“环烷醚基”是指：(环烷基)-o-的基团。其中的“环烷基”部分见本文有关定义。
[0129]“杂烷醚基”是指：(杂烷基)-o-的基团。其中的“杂烷基”部分见本文有关定义。
[0130]“芳醚基”是指：(芳基)-o-的基团。其中的“芳基”部分见本文有关定义。
[0131]“芳基烷醚基”是指：(芳基-烷基)-o-的基团。其中的“芳基”和“烷基”部分见本文有关定义。
[0132]“杂芳醚基”是指：(杂芳基)-o-的基团。其中的“杂芳基”部分见本文有关定义。
[0133]“杂芳基烷醚基”是指：(杂芳基-烷基)-o-的基团。其中的“杂芳基”和“烷基”部分见本文有关定义。
[0134]“杂环烷醚基”是指：(杂环烷基)-o-的基团。其中的“杂环烷基”部分见本文有关定义。
[0135]“杂环烷氨基”是指：单-杂环烷基氨基和二-杂环烷基氨基两种，除非另有说明。单-杂环烷基氨基是指：(杂环烷基-)nh-的基团；二-杂环烷基氨基是指(杂环烷基)2n-的基团。其中的“杂环烷基”部分的定义见本文相关部分。
[0136]“芳基烷氨基”是指：单-芳基烷基氨基和二-芳基烷基氨基两种，除非另有说明。单-芳基烷基氨基是指：(芳基-烷基)-nh-的基团；二-芳基烷基氨基是指(芳基-烷基)
2-n-的基团。其中的“芳基”和“烷基”部分的定义见本文相关部分。
[0137]“环烷基氨基”是指：单-环烷基氨基和二-环烷基氨基两种，除非另有说明。单-环烷基氨基是指：(环烷基)-nh-的基团；二-芳基烷基氨基是指(环烷基)
2-n-的基团。其中的“环烷基”部分的定义见本文相关部分。
[0138]“芳基氨基”是指：单-芳基氨基和二-芳基氨基两种，除非另有说明。单-芳基氨基是指：(芳基)-nh-的基团；二-芳基氨基是指(芳基)
2-n-的基团。其中的“芳基”部分的定义见本文相关部分。
[0139]“杂芳基氨基”是指：单-杂芳基氨基和二-杂芳基氨基两种，除非另有说明。单-杂芳基氨基是指：(杂芳基)-nh-的基团；二-杂芳基氨基是指(杂芳基)
2-n-的基团。其中的“杂芳基”部分的定义见本文相关部分。
[0140]“杂芳基烷基氨基”是指：单-杂芳基烷基氨基和二-杂芳基烷基氨基两种，除非另有说明。单-杂芳基烷基氨基是指：(杂芳基-烷基)-nh-的基团；二-杂芳基烷基氨基是指(杂芳基-烷基)
2-n-的基团。其中的“杂芳基”和“烷基”部分的定义见本文相关部分。
[0141]
除非另有说明，本发明的亚基是指二价基团，即是指一价基团中一个氢原子被化合价替代的基团。例如，“亚杂烷基”是指其中一个氢原子被化合价替代的杂烷基；“亚杂环
基”是指其中一个氢原子被化合价替代的杂环基；“亚芳基”是指其中一个氢原子被化合价替代的芳基；“亚烷基”是指其中一个氢原子被化合价替代的烷基；“亚烯基”是指其中一个氢原子被化合价替代的烯基；“亚环烷基”是指其中一个氢原子被化合价替代的环烷基；“亚杂芳基”是指其中一个氢原子被化合价替代的杂芳基；“亚杂环烷基”是指其中一个氢原子被化合价替代的杂环烷基；“亚杂环烯基”是指其中一个氢原子被化合价替代的杂环烯基；“亚烷氧基”是指其中一个氢原子被化合价替代的烷氧基；“亚烯氧基”是指其中一个氢原子被化合价替代的烯氧基；“亚炔氧基”是指其中一个氢原子被化合价替代的炔氧基等。其中，上述杂环基、芳基、烷基、烯基、环烷基、杂芳基、杂环烷基、杂环烯基、烷氧基、烯氧基、炔氧基等的定义见本文的相关定义。
[0142]
本发明包括通式(i)所表示的化合物及其可能的各种异构型式。包括：非镜像异构体、镜像异构体、互变异构体和“e”或“z”构型异构体的几何异构体等。任何具有一定基础的化学工作者均可以分离出上述光学纯或者立体异构纯的化合物。
[0143]
除此之外，这里未定义的基团遵照通常的定义。
[0144]
本发明优选的方式可以列举以下方式。
[0145]
在本发明的化合物中，r1优选为氢原子、羧基、硝基、氨基、氰基、酰基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、卤素、同位素、卤代烯基、杂烷基、芳基烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、杂环烯基、烷氧基烷基、烯氧基、炔氧基、烷基氨基、氨基烷基、烷基氨基羰基、磺酰基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、或氨基磺酰基；上述基团中的任一基团独立地可以被一个或多个取代基取代，这些取代基包括但不限于卤素、同位素、氨基、氰基、羧基、苯基、苄基、苯基氧基、＝o、-cf3、卤代烷基、烷基、烯基、炔基、羟基、羟烷基、烷氧基、和烷氧基烷基。
[0146]
r1更优选为氨基、氰基、烯基、炔基、卤素、同位素、c1-c6烷基、c6-c12芳基、5-12元芳基c1-c6烷基、c3-c9环烷基、4-15元杂芳基、4-15元杂芳基c1-c6烷基、3-14元杂环烷基、或c1-c6烷氧基；上述基团中的任一基团各自独立地可以被选自上述取代基组a中的一个或多个取代基取代，这些取代基包括但不限于卤素、同位素、氨基、氰基、羧基、＝o、-cf3、烷基、羟基、羟烷基、烷氧基。
[0147]
r1进而优选为氰基、炔基、卤素、同位素、或c1-c6烷基、吡唑基、呋喃基、嘧啶基、氨基吡唑基、吗啉基、或苯基；上述基团中的任一基团独立地可以被一个或多个取代基取代，这些取代基包括但不限于卤素、同位素、氨基、氰基、羧基、苯基、苄基、苯基氧基、＝o、-cf3、卤代烷基、烷基、羟基、羟烷基、烷氧基。
[0148]
在本发明的化合物中，l1选优为-ch2ch
2-、-ch＝ch-、或-c≡c-。
[0149]
l1更优选为-ch＝ch-、或-c≡c-。。
[0150]
在本发明的化合物中，l2选优为亚烷基、羰基、-co-nh-，-烷基-co-nh-，-烷基-nh-，或-烷基-o-。上述基团中的任一基团各自独立地可以被一个或多个取代基取代，这些取代基包括氢原子、烷基。
[0151]
l2更优选为-co-nh-、-烷基-co-nh-、-烷基-nh-c(o)-、-烷基-nh-，或-烷基-o-。上述基团中的任一基团各自独立地可以被一个或多个取代基取代，这些取代基包括氢原子、烷基。
[0152]
l3优选为：共价键、亚烷基、-o-、-nh-、-c(o)-nh-，-nh-c(o)-、-烷基-c(o)-nh-、-烷基-nh-c(o)-，-烷基-nh-，-烷基-o-。上述基团中的任一基团各自独立地可以被一个或多
个取代基取代，这些取代基包括氢原子、烷基。
[0153]
l3优选为：共价键、
–
o-、-nh-、-c(o)-nh-，-nh-c(o)-。
[0154]
在本发明的化合物中，r2优选为羧基、氨基、酰基、烷基、烷氧基、杂烷基、芳基烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、杂环烯基、烷氧基烷基、烯氧基、炔氧基、烷基氨基、氨基烷基、烷基氨基羰基、磺酰基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、或氨基磺酰基；上述基团中的任一基团独立地可以被一个或多个取代基取代，这些取代基包括但不限于卤素、同位素、氨基、氰基、羧基、苯基、苄基、苯基氧基、＝o、-cf3、卤代烷基、烷基、烯基、炔基、羟基、羟烷基、烷氧基、和烷氧基烷基。
[0155]
r2更优选为c1-c6烷基、c6-c12芳基、5-12元芳基c1-c6烷基、c3-c9环烷基、4-15元杂芳基、4-15元杂芳基c1-c6烷基、3-14元杂环烷基、c1-c6烷氧基c1-c6烷基；上述基团中的任一基团各自独立地可以被选自上述取代基组a中的一个或多个取代基取代，这些取代基包括但不限于卤素、同位素、氨基、氰基、羧基、苯基、＝o、-cf3、卤代烷基、烷基、烯基、炔基、羟基、羟烷基、烷氧基、和烷氧基烷基。
[0156]
r2进而优选为吡唑基、呋喃基、嘧啶基、溴代嘧啶基、氨基吡唑基、吗啉基、苯基；上述基团中的任一基团独立地可以被一个或多个取代基取代，这些取代基包括但不限于卤素、同位素、氰基、烷基、烯基、炔基、羟基、羟烷基、烷氧基、和烷氧基烷基。
[0157]
在本发明的化合物中，r3优选为：氢原子、烷基、杂烷基、芳基烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、烷基醚基、杂烷基醚基、芳基烷醚基、环烷醚基、芳醚基、杂芳醚基、杂芳基烷醚基、杂环烷醚基、烷基氨基、杂烷氨基、芳基烷氨基、环烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、杂芳基烷基氨基、杂环烷基氨基；上述基团中的任一基团各自独立地可不被取代或者可以被一个或多个取代基取代，这些取代基包括但不限于卤素、同位素、＝o、-cf3、卤代烷基、烷基、烯基、炔基、羟基、羟烷基、烷氧基、烷氧基烷基、杂烷基、芳基烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、杂环烯基、烷氧基烷基、烯氧基、炔氧基、烷基氨基、氨基烷基、烷基氨基羰基、磺酰基、烷基磺酰基、烷基亚磺酰基、或氨基磺酰基。
[0158]
r3更优选为甲基、乙基、芳基烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烷基、杂环烯基、烷氧基烷基、烯氧基、炔氧基、烷基氨基，或氨基烷基；上述基团中的任一基团各自独立地可不被取代或者可以被一个或多个取代基取代，这些取代基包括但不限于卤素、同位素、氨基、苯基、苄基、苯基氧基、＝o、-cf3、卤代烷基、烷基、杂烷基、烯基、炔基、羟基、羟烷基、烷氧基、烷氧基烷基、杂烷基、芳基烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环烯基、烷氧基烷基。
[0159]
本发明包括通式(i)所表示的化合物及其可能的各种异构型式。包括：非镜像异构体、镜像异构体、互变异构体和“e”或“z”构型异构体的几何异构体等。本领域技术人员可以根据本领域的常规手段分离出上述光学纯或者立体异构纯的化合物。
[0160]
本发明包括通式(i)所表示的化合物及其可能的消旋体或/和镜像异构物/或/和非镜像异构物的混合物。
[0161]
此外，通式(i)所表示的化合物在应用上也涵盖该化合物的溶剂化及非溶剂化形式。因此，各形式均包括具有所指明构造的化合物，包括其水合物及无水物。
[0162]
除了通式(i)所表示的化合物之外，不同具体实施方案的激酶抑制剂包括：药学上可接受的盐，前药和这些化合物的活性代谢物、和这些代谢物的药学上可接受的盐。
[0163]
术语“药学上可接受的盐”是指上述化合物能保持原有生物活性并且适合于医药用途的某些盐类。通式(i)所表示的化合物的药学上可接受的盐有两种形成形式：一种是与酸形成的盐；另一种是与碱或者碱金属形成的盐。与通式(i)所表示的化合物形成药学上可接受的盐的酸包括无机酸和有机酸。合适的无机酸包括：盐酸，硫酸和磷酸。合适的有机酸可选自脂肪族、环脂肪族、芳香性、杂环羧酸和磺酸类有机酸；其实例包括但不限于：甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、甘醇酸、葡萄糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、甘氨酸、精氨酸、柠檬酸、反丁烯二酸、烷基磺酸、芳基磺酸等。与通式(i)所表示的化合物形成药学上可接受的盐的碱金属包括：锂、钠、钾、镁、钙、铝、锌等；与通式(i)所表示的化合物形成药学上可接受的盐的碱包括：胆碱、二乙醇胺、吗啉等。
[0164]“前药”是一种通式(i)所表示的化合物的衍生物，借助于在体内代谢的方式将其于活体内转化(例如：通过水解，还原或氧化)成通式(i)所表示的化合物。例如，可以将通式(i)所表示的含有羟基基团的化合物与酸反应制备成相应的酯。相应的酯即为前药，可以在活体内水解母体药物。适合来制备“前药”的酸包括但不限于：乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、草酸、水杨酸、琥珀酸、反丁烯二酸、顺丁烯二酸、亚甲基-双-β-羟基萘酸、龙胆酸、羟乙基磺酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等。
[0165]
本发明所指的激酶抑制剂包括ic
50
值为10μm或更低的那些化合物。本发明所指的激酶包括但不限于ret、trk。
[0166]
通式(i)所表示的化合物的给药方式可以是胃肠道给药也可以是非胃肠道给药。胃肠道给药是指经口或经直肠给药。非胃肠道给药方式包括：皮下、肌肉、静脉内和皮肤内等途径。通常，通式(i)所表示的活性化合物在给药时可以使用药学上可接受的载体或稀释剂。
[0167]“治疗有效量”或“治疗量”均是指足以产生疗效的量。有效量可分一或多次给药。通常，有效量足以缓和、改善、稳定、减慢或延迟疾病的进一步发展。
[0168]
本发明的化合物可单独使用，也可以与其它一种或者多种药物联合使用；或者用于正在接受手术或者放射线治疗的患者，其中本发明的化合物与所述手术或放射性治疗伴随地、或在手术或放射性治疗之前、或在手术或放射性治疗之后施用于所述患者；或与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂做成一定的剂型给药。具体的剂型依据给药途径而定。
[0169]
本发明的非肠道注射用药物配方包括药学上可接受的无菌水剂或非水溶液、分散剂、悬浮剂或乳化剂以及使用前才配成可注射的无菌水溶液的粉针剂。
[0170]
若需要，并为了更有效的分布，可将本发明的化合物并入缓慢释放或目标传送系统、例如：聚合物基质，脂质体和微球体内。
[0171]
口服给药的固态剂型包括：胶囊，药锭，药片，粉末和颗粒。在这些固体剂型中，含有通式(i)所表示的活性化合物和至少一种惰性并且药学上可接受的赋形剂或载体。这些赋形剂或载体包括柠檬酸钠或磷酸二钙和/或a)填充剂或增量剂，例如：淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和水杨酸；b)结合剂，例如：羧甲基纤维素、褐藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；c)崩解剂，例如：洋菜胶、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶解延迟剂，例如：石蜡；f)吸收加速剂，例如：季铵化合物；g)湿润剂，例如：鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸附剂，例如：高岭土和皂土；和i)润滑剂，例如：滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固态聚乙二醇。
[0172]
固态剂型的药锭、糖衣锭、胶囊、药片和颗粒可制备成具有涂层或外壳。
[0173]
活性化合物亦可呈微胶囊形式给药。如需要，可具备一或多种上述的赋形剂。
[0174]
经口给药的液态剂型包括药学上可接受的乳化剂、溶液、悬浮剂、糖浆等。除了活性化合物以外，该液态剂型可含有普遍用于液态剂型中的惰性稀释剂，例如：水或其他溶剂、稳定剂和乳化剂，例如：乙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲酸醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽，落花生，玉米，胚芽，橄榄，蓖麻和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和山梨醇酐的脂肪酸酯类等。
[0175]
除了惰性稀释剂的外，口服组合物亦可包括：辅料，例如：湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、香料和调香剂。
[0176]
在悬浮液中，除了活性化合物以外，可含有悬浮剂，例如：乙氧基异硬脂醇类、聚氧乙烯山梨醇和山梨醇酐酯等。
[0177]
用于直肠或阴道给予的组合物优选为栓剂，其可通过将本发明的化合物与适当的非刺激性赋形剂或载体混合而制备。
[0178]
本发明化合物的局部给药用的剂型包括粉末、贴片、喷剂、油膏和吸入剂，其可通过将活性化合物在无菌条件下与药学上可接受的载体和所需的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合而制备。
[0179]
本发明化合物优选的剂量范围为每公斤体重每天约为0.01-400毫克。更优选的剂量范围为每公斤体重每天为0.2-100毫克。也可以选择适当的剂量每天多次分别给药。
[0180]
本发明的吡唑并[1,5-a]吡啶类衍生物可作为但不限于作为激酶抑制剂。本发明公开吡唑并[1,5-a]吡啶衍生物可以单独使用也可以与其它药物或者药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起使用，适用于预防或治疗由细胞增殖和/或血管新生的破坏所导致、或与该破坏相关联或相伴随的病症。这些病症的例子之一为癌症。
[0181]
本发明的化合物亦可用于治疗涉及或至少一部分通过trk、ret、fghr、pdgfr、vegfr等任何一种或者多种激酶活性所调节，其中己知trk、ret活性对于促使疾病发作扮演某种角色，或者该等征状已知或己显示可通过trk、ret抑制剂予以减轻。预期可通过本发明的化合物加以治疗的此型病症包括但不限于下列：抗增生性病症(例如：癌症)；神经变性疾病，包括：亨廷顿病、聚谷氨酰胺病、帕金森病、阿尔茨海默病、癫痫发作、纹状体黑质变性、进行性核上性麻痹、扭转张力不全、痉挛性斜颈和运动障碍、家族性震颤、抽动秽语综合征、弥漫性路易体疾病、进行性核上性麻痹、皮克病、颅内出血、原发性侧索硬化症、脊髓性肌肉萎缩症、肌萎缩侧索硬化症、肥大性间质性多神经病、视网膜色素变性、遗传性视神经萎缩、遗传性痉挛性截瘫、进行性共济失调症和shy-drager综合征；代谢性疾病，包括：2型糖尿病；眼部退化疾病，包括：青光眼、老年黄斑变性、虹膜红变性青光眼；炎性疾病和/或免疫系统病症，包括：类风湿性关节炎(ra)、骨性关节炎、青少年慢性关节炎、移植物抗宿主病、牛皮癣、哮喘、脊椎关节病变、牛皮癣、克罗恩病、炎性肠病、结肠溃疡、酒精性肝炎、糖尿病、sjoegrens综合征、多发性硬化症、强直性脊椎炎、膜性肾小球病、椎间盘性疼痛、全身性红斑狼疮；涉及血管新生的疾病，包括：癌症、牛皮癣、类风湿性关节炎；心理病症，包括：双相性精神障碍、精神分裂症、躁狂症、抑郁和痴呆：心血管疾病包括；心力衰竭、再狭窄和动脉硬化；纤维化疾病，包括：肝纤维化、囊性纤维病和血管纤维瘤；感染性疾病，包括：真菌感染，例如：白色念珠菌、细菌感染、病毒性感染，例如：单纯疱疹、原虫感染，例如：疟疾、利什
曼原虫感染、布氏锥虫感染、弓形体病和球虫病和造血性病症，包括：海洋性贫血、贫血和镰状细胞性贫血。
[0182]
本说明书中所使用的术语“癌症”一般是指广泛的以细胞的失控性异常生长为特征的病症。
[0183]
本发明的化合物预期可用于治疗各种癌症，包括但不限于：骨癌类，包括：尤因肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤等；脑和cns肿瘤，包括：听神经瘤、神经母细胞瘤、神经胶瘤和其他脑肿瘤，脊髓肿瘤、乳癌、结肠直肠癌、进展期结肠直肠腺癌；内分泌癌类，包括：肾上腺皮质癌、胰癌、脑垂体癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、胸腺癌、多发性内分泌肿瘤；胃肠癌类，包括：胃癌、食道癌、小肠癌、肾细胞癌、肝癌、肝外胆管癌、胃肠类癌性肿瘤、胆囊癌；泌尿生殖器癌类，包括：翠丸癌、阴茎癌、前列腺癌；妇科癌类，包括：子宫颈癌、卵巢癌、阴道癌、子宫/子宫内膜癌、阴部癌、妊娠滋养细胞肿瘤、输卵管癌、子宫肉瘤；头和颈部肿瘤类，包括：口腔癌、唇癌、唾腺癌、喉头癌、下咽癌、正咽癌、鼻癌、鼻窦癌、鼻咽癌；血癌类，包括：儿童白血病、急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、发状细胞性白血病、急性早幼粒细胞白血病、血浆细胞性白血病；骨髓癌血液病症，包括：骨髓分化不良症候群、骨髓增生性病症、再生障碍性贫血、范禾尼贫血、特发性巨球蛋白血症；肺癌类，包括：小细胞肺癌、非小细胞肺癌；淋巴癌类，包括：霍奇金病、非霍奇金氏淋巴瘤、皮肤型t-细胞淋巴瘤、周围t-细胞淋巴瘤、aids相关性淋巴瘤；眼癌类，包括：视网膜母细胞瘤、葡萄膜黑色素瘤、皮肤癌类，包括：黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌、梅克尔细胞癌、软组织肉瘤类，例如：儿童软组织肉瘤、成人软组织肉瘤、卡波希肉瘤、泌尿系统癌症，包括：肾癌维尔姆斯肿瘤、膀胱癌、尿道癌和转移性细胞癌。
[0184]
本发明化合物可用来治疗的癌症首先包括但不限于：乳癌、肺癌、肾细胞癌、胃癌、卵巢癌、甲状腺癌、直肠癌、前列腺癌、头和颈部癌、肾、胃和脑癌。
[0185]
可通过本发明的化合物加以治疗的优选癌类为固态肿瘤和血液恶性疾病。
[0186]
此外，本发明的化合物可用于治疗对于其他化疗法治疗具有抗性的增生性疾病；及用于治疗高增生疾病，例如：白血病、牛皮癣等。
[0187]
实施例_新型吡唑并[1,5-a]吡啶衍生物的合成及应用
[0188]
本发明通式(i)所表示的化合物可以用下面讨论的合成路线和合成方法来合成。所用原材料方便易得。但是，本发明所用的合成路线和合成方法，可以广泛应用于类似物的合成，只需要变换起始原材料即可。例如，在本文实例中没有详细描述的化合物的合成，只要把起始原材料更换成相应目标化合物的起始原材料，依据化学常识，在有必要时稍为改变一下反应条件即可合成出所需要的目标化合物。
[0189]
各具体实施方案的试剂可利用说明如下的反应途径或合成流程图，使用本领域的技术手段，以可取得的起始原料加以制备。具体实施方案的特定化合物的制备详细说明于下列实施例中，但熟悉此项技术的本领域技术人员知道所说明的化学反应可适用于制备不同具体实施方案中的多种其他化合物。例如：非示例化合物的合成可成功地通过本领域技术人员显而易见的修饰加以施行，例如：通过适当地保护干扰基团，通过改变成该项技术中已知的其他适当的试剂，或通过进行反应条件的例行性修饰。本文中揭示或本领域中已知的其他反应可被认定为具有用于制备各具体实施方案的其他化合物的适用性。
[0190]
用于合成化合物的试剂可根据本领域中已知的技术加以取得或制备。
[0191]
在下列实例中，除非另有指明，所有温度为摄氏度。
[0192]
各种起始原料和试剂均来自市售。供应商包括但不限于：aldrich chemical company、lancaster synthesis ltd等等。市售原料和试剂均不经进一步纯化直接使用，除非另有指明。
[0193]
玻璃器皿用烘箱干燥和/或加热干燥。反应用玻璃硅胶-60f254平板(0.25mm)(tlc)上进行跟踪。分析性薄层层析并以适当的溶剂比例(v/v)加以展开。以tlc上起始物质耗尽时为反应终点。
[0194]
通常，后续处理是用反应所用的溶剂将反应液的体积增大一倍，然后用总体积的25％萃取溶剂来进行萃取三次，除非另有指明。将含产物萃取经无水硫酸钠脱水，在加以过滤于旋转蒸发器上，于减压之下将溶剂蒸发并注意溶剂于真空中的去除。最后，用快速柱层析分离得到目标化合物。
[0195]1h nmr图谱是用bruker仪器(400mhz)测定而得，化学位移用ppm表示。使用氯仿作为参照标准(7.25ppm)或四甲基硅烷内标准(0.00ppm)。视需要，也可以使用其它nmr常用的溶剂。1h nmr的表示方法：s＝单峰，d＝双重峰，t＝三重峰，m＝多重峰，br＝变宽的，dd＝双重峰的双重峰，dt＝三重峰的双重峰。若提供偶合常数时，其单位为hz。
[0196]
质谱是用lc/ms仪测定得到，离子化方式可为esi或apci。所有熔点均未经修正。
[0197]
下面的实例仅仅是用来说明所发明的具体化合物的合成方法。但在合成方法上并没有任何限制。在下面未列出的化合物，也可以用与下面同样的合成路线与合成方法，选择适当的起始原材料、在有必要的地方稍加适当的常识性的反应条件调整即可加以制备。
[0198]
合成
[0199]
通式(i)中所示的化合物,当l2＝-c(o)-nh-时，合成方法如下：选择合适的i作为原料，在合适的催化剂和合适的条件下(例如，在1-十二硫醇的作用下)脱去甲基，得到化合物ii。在催化下，化合物ii与硼化合物iii作用得到iv。在n-苯基双(三氟甲磺酰亚胺)(1,1,1-trifluoro-n-phenyl-n-((trifluoromethyl)sulfonyl)methanesulfonamide)的作用下，化合物iv即转化为化合物v。而另一方面，化合物vi与化合物vii经过缩合所得的化合物viii，与化合物v反应，即得到化合物ix，即同通式(i)所示的目标化合物(合成路线1)，
[0200]
合成路线1
[0201]
[0202]
当通式(i)中的r1＝-cn时，可以用合成路线2来合成。此时，合成方法为：选择合适的x作为原料，经过酰化、氨化，得到xiv。在酸作用下，环合得到化合物xvi。在化合物xvi上引入甲酰基，后者经羟胺化转为晴基。经过在合适的催化剂和合适的条件下(例如，在1-十二硫醇的作用下)脱去甲基，得到化合物i-1。
[0203]
合成路线2
[0204][0205]
通式(i)中所示的化合物,当l1＝-ch＝ch-或-c≡c-，l
2-r2为取代芳基时，相应的目标化合物，即化合物xxiii可用合成路线3所示的方法来合成。方法如下：选择合适的碘代化合物xix作为原料，在合适的催化剂和合适的条件下与xx反应，得到化合物xxi。然后在碱性甲醇溶液中除硅保护基吗，得到xxii。后者与化合物v反应，得到化合物xxiii。
[0206]
合成路线3
[0207][0208]
下面结合实例进一步阐明本发明的内容。目的在于让具备有本领域相关的基本知识的技术人员更加清楚的了解并实践本发明的具体内容。但是，本发明的保护范围并不仅仅局限于这些实例。
[0209]
实施例_1(s)-3-(3-氰基-6-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)吡唑[1,5-a]吡啶-4-基)-n-(1-(1-甲基-1h-咪唑-4-基)甲基)吡咯烷-3-基)丙酰胺的合成(ix-1)
[0210]
step-1 6-溴-4-羟基吡唑并[1,5-a]吡啶-3-腈(ii-2)的合成：
[0211]
[0212]
将化合物6-溴-4-甲氧基吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲腈(i-1)(100.0g,396.7mmol,1.0eq)加入n,n-二甲基甲酰胺(1000.0ml,10.0vol)中，搅拌下将体系升温至40℃～50℃，加入预先配好并冷却至室温的氢氧化钠(31.7g,793.4mmol,2.0eq)和水(64.9ml,0.65vol)的混合溶液，控温40-50℃，将正十二硫醇(160.6g,793.4mmol,2.0eq)缓慢滴加至反应体系中，投料完毕后，保温45℃～50℃反应10～12h。hplc监控反应完毕后，将体系降温至10-20℃并控制在此温度范围内，缓慢向体系中加入水(3000.0ml,30.0vol)淬灭，加入甲基叔丁基醚(1000.0ml*2,10.0vol*2)萃取，分离水相，降温至0-10℃并控制在此温度范围内，将预先配好的10％柠檬酸溶液(约1200g)缓慢加入水相中，调节ph＝5～6，大量固体析出，保温0-10℃搅拌10～20min，抽滤，滤饼以水(300.0ml*2,3.0vol*2)洗涤，抽干，将滤饼转入烘箱中50-60℃烘干得到类白色固体ii-2(88.0g,93.2％)。1h mnr(400mhz,dmso-d6)δ:8.87-8.75(m,1h),8.62-8.51(m,1h),8.03-7.89(m,1h),6.95-6.84(m,1h).esi-ms(m/z):239.8[m+h]+.
[0213]
step-2 4-羟基-6-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)吡唑[1,5-a]吡啶-3-腈iv-1的合成：
[0214][0215]
将化合物6-溴-4-羟基吡唑并[1,5-a]吡啶-3-腈(ii-1)(55.0g,231.1mmol,1.0eq)和碳酸钾(63.8g,462.1mmol,2.0eq)加入二氧六环(1100.0ml,20.0vol)和水(275.0ml,5.0vol)的混合溶液中，搅拌下将催化剂四三苯基膦钯(13.4g,11.6mmol,0.05eq)加入反应体系中，氮气置换5次，将体系升温至95-100℃反应4～5h。hplc监控反应完毕后，将体系降温至10-20℃并控制在此温度范围内，缓慢向体系中加入水(3300.0ml,60.0vol)淬灭，过硅藻土垫，滤液加入甲基叔丁基醚(1100.0ml*3,20.0vol*3)萃取，分离得到水相，控温15-25℃，将预先配好的1m稀盐酸溶液缓慢加入水相中，调节ph＝5～6，大量固体析出，保温15-25℃搅拌10～20min，抽滤，滤饼以水(275.0ml*2,5.0vol*2)洗涤，抽干，将滤饼转入烘箱中50-60℃烘干得到灰色固体iv-1(51.6g,93.4％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:11.36(s,1h),8.74(s,1h),8.50(s,1h),8.21(s,1h),7.94(s,1h),6.96(s,1h),3.88(s,3h).esi-ms(m/z):240.1[m+h]
+
.
[0216]
step-3 3-氰基-6-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)吡唑[1,5-a]吡啶-4-基三氟甲磺酸酯(v-1)的合成:
[0217][0218]
将化合物4-羟基-6-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)吡唑[1,5-a]吡啶-3-腈(iv-1)(73.6g,307.6mmol,1.0eq)溶于n,n-二甲基乙酰胺(1472.0ml,20.0vol)中，控温10-20℃，将n-苯基双三氟甲基磺酰亚胺(120.9g,338.4mmol,1.1eq)分批加入体系中，将体系降温至
10-15℃并控制在此温度范围内，将n,n-二异丙基乙胺(79.5g,615.2mmol,2.0eq)缓慢滴加至体系中，滴加完毕后控温10-15℃反应4～5h。hplc监控反应完毕后，将体系降温至0-10℃并控制在此温度范围内，缓慢向体系中加入水(3200.0ml,43.5vol)淬灭，大量固体析出，保温10-20℃搅拌10～20min，抽滤，滤饼以水(441.6ml*2,6.0vol*2)洗涤，抽干，将滤饼转入烘箱中50-60℃烘干得到灰白色固体v-1(112.0g,98.0％)。1hnmr(40 0mhz,dmso-d6)δ:9.53-9.28(m,1h),8.90-8.64(m,1h),8.58-8.29(m,1h),8.25-7.89(m,2h),4.01-3.68(m,3h).esi-ms(m/z):372.0[m+h]
+
.
[0219]
step-4 3-(s)-丙酰氨基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(viii-1)的合成：
[0220][0221]
将化合物3-(s)-氨基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(vi-1)(1.8g,9.6mmol,1.0eq)加入二氯甲烷(100ml,55.5vol)中，氮气保护条件下，加入2-乙氧基-1-乙氧碳酰基-1,2-二氢喹啉(eedq，2.8g,11.6mmol,1.2 0eq)和丙炔酸(vii.1,678mg,9.6mmol 1.0eq)，控温20-30℃搅拌反应15-20h。tlc监控反应完毕后，将体系浓缩，残留物以硅胶柱层析纯化，以石油醚/乙酸乙酯＝5/1和石油醚/乙酸乙酯＝2/1作为洗脱剂，浓缩得到黄色固体viii-1(1.50g,65％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:6.37-6.47(d,j＝42hz,1h),4.47-4.51(dd,j＝5.4hz,1h),3.59-3.63(dd,j＝6.0hz,1h),3.45(s,2h),3.25-3.30(d,j＝19.6hz,1h),2.83(s,1h),2.14-2.19(m,1h),1.83(s,1h),1.47(s,9h).esi-ms(m/z):237.2[m-h]-[0222]
step-5 3-(s)-(3-氰基-6-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)吡唑[1,5-a]吡啶-4-基)-n-(吡咯烷-3-基)丙酰胺(ix-1)盐酸盐的合成：
[0223][0224]
氮气保护条件下，将3-氰基-6-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)吡唑[1,5-a]吡啶-4-基三氟甲磺酸酯(v-1)(0.82g,2.2mmol,1.0eq)和3-(s)-丙酰氨基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(viii-1)(0.80g,3.4mmol,1.5eq)溶于n,n-二甲基乙酰胺(50.0ml,60.0vol)中，加入碘化亚铜
(0.042g,0.22mmol,0.1eq)、n,n-二异丙基乙胺(0.571g,4.4mmol,2.0eq)和催化剂双三苯基磷二氯化钯(0.154g,0.22mmol,0.1eq)，氮气置换6次，将体系升温至95-100℃反应1～2h。tlc监控反应完毕后，将体系倒入水(200.0ml)中淬灭，抽滤，滤饼以硅胶柱层析纯化，以石油醚/乙酸乙酯＝1/1和乙酸乙酯作为洗脱剂，浓缩得到白色固体key intermediate-1(0.59g,58％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.71(s,1h),8.30(s,1h)，7.79-7.83(d,j＝17.6hz,2h),7.69(s,1h)，7.28(s,1h)，4.55(s,1h)，4.03(s,3h)，3.66-3.70(dd,j＝6.4hz,1h),3.30-3.53(m,3h),2.07(s,1h),1.93-1.98(m,1h),1.50(s,9h).esi-ms(m/z):404.0[m+h-56]
+
.
[0225]
将3-(s)-(3-氰基-6-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)吡唑[1,5-a]吡啶-4-基)丙酰胺基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(key intermediate-1)(500mg,1.08mmol,1.0eq)溶于乙酸乙酯(38.5ml,77.0vol)中，加入4m氯化氢乙酸乙酯溶液(3.85ml,7.7vol),控温20-30℃搅拌反应15-20h。tlc监控反应完毕后，抽滤体系，滤饼以乙酸乙酯洗涤，用水和乙醇重结晶，得到黄色固体，即目标化合物1(ix-1)(305mg,71％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:9.42(d,j＝11.2hz,1h),9.22(d,j＝6.4hz,2h),8.75(d,j＝8.0hz,1h),8.39(s,1h),8.29(br,1h),8.13(s,1h),4.43-4.48(q,j＝6.4hz,1h),3.89(s,3h),3.42-3.46(m,1h),3.21-3.30(m,3h),3.05-3.09(m,1h),2.14-2.23(m,1h),1.87-1.95(m,1h).esi-ms(m/z):360.2[m+h]
+
.
[0226]
实施例_2 6-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-4-(5-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-4-基)乙炔基)吡唑[1,5-a]吡啶-3-腈(2)的合成
[0227]
step-1叔丁基(均三甲苯磺酰基)氧基氨基甲酸酯(xii)的合成:
[0228][0229]
将2,4,6-三甲基苯-1-磺酰氯(x)(50.0g，0.228mol)和羟基氨基甲酸叔丁酯(xi，30.4g，0.228mol)的叔丁基甲基醚(500ml)溶液冷却至0℃。逐滴加入三乙胺(25.4g，0.25mol)。加完后，将混合物在0℃下搅拌0.5小时。然后将混合物加热至室温并搅拌2小时。过滤混合物。将滤液用水(100ml)和盐水(50ml)洗涤，用na 2
so 4
干燥并浓缩，得到残余物。将残余物用石油醚(50ml)研磨并过滤。收集滤饼并干燥，得到标题化合物xii(60.2g，收率84％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:7.57(br s,1h),6.99(s,2h),2.68(s,6h),2.32(s,3h),1.32(s,9h).
[0230]
step-2 1-氨基-3-溴-5-甲氧基吡啶-1-鎓2,4,6-三甲基苯磺酸盐(xiv)的合成:
[0231][0232]
将三氟乙酸(100ml)冷却至0℃并分批加入叔丁基(均三甲苯磺酰基)氧基氨基甲
酸酯(xii)(60.0g，0.19mol)。加完后，将混合物在20℃下搅拌2小时。逐滴加入冰水(300ml)并将混合物搅拌0.5小时并过滤。将滤饼用水(50ml
×
3)洗涤并收集，得到相应中间体(58g，湿重),为白色固体。产物无需进一步纯化即可立即用于下一步。
[0233]
将中间体(58g，湿重)溶解在二氯甲烷(300ml)中，用na2so4干燥5分钟并过滤。将滤液冷却至0℃。分批加入3-溴-5-甲氧基吡啶(xiii)(35.8g，0.19mol)。加完后，将混合物在室温下搅拌2小时。过滤混合物。将滤饼用二氯甲烷(50ml
×
2)洗涤，收集并干燥，得到标题化合物(xiv)(48.2g，收率63％)，为白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.71(s,1h),8.62(s,1h),8.59(s,2h),8.27(s,1h),6.74(s,2h),3.97(s,3h),2.50(s,6h),2.17(s,3h).
[0234]
step-3 6-溴-4-甲氧基吡唑并[1,5-a]吡啶(xvi)的合成：
[0235][0236]
将1-氨基-3-溴-5-甲氧基吡啶-1-基2,4,6-三甲基苯磺酸酯(xiv)(48.0g，0.12mol)的n，n-二甲基甲酰胺(150ml)溶液冷却至0℃。逐滴加入三乙胺(24.1g，0.24mol)。加完后，将混合物在0℃下搅拌5分钟。逐滴加入丙炔酸乙酯(xv)(23.3g，0.24mol)。加完后，将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物倒入水(500ml)中并用乙酸乙酯(100ml
×
4)萃取。将合并的有机相用盐水(50ml)洗涤，用na2so4干燥并浓缩。通过硅胶柱色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝5：1)纯化残余物，得到粗制中间体(28g)，为黄色固体。将固体溶于氢溴酸(48％水溶液，60ml)中并回流1.5小时。然后将混合物在室温下搅拌过夜。过滤混合物。将滤饼用水(10ml
×
5)洗涤并干燥，得到标题化合物(3.0g)，为黄色固体。合并滤液，用乙酸乙酯(50ml
×
2)萃取。将合并的有机相用盐水(20ml)洗涤，用na2so4干燥并浓缩，得到残余物。通过硅胶柱色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝10：1)纯化残余物，得到标题化合物(1.20g)，为白色固体。合并两批产物，得到标题化合物(xvi，4.2g，收率16％)，为黄色固体。lc-ms[mobile phase:from 95％water and 5％ ch3cn to 5％water and 95％ ch3cn in 2.5min],rt＝1.58min；purity:100％；ms calcd:226.0；ms found:226.9[m+h]
+
.1h nmr(300mhz,cdcl3)δ:8.28(s,1h),7.85(d,j＝1.8hz,1h),6.63(d,j＝1.5hz,1h),6.46(s,1h),3.96(s,3h).
[0237]
step-4 6-溴-4-甲氧基吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲醛(xvii)的合成:
[0238][0239]
在0℃，向6-溴-4-甲氧基吡唑并[1,5-a]吡啶(xvi)(3.0g，13.2mmol)的n,n-二甲基甲酰胺(75ml)溶液中逐滴地加入三氯氧磷(6.10g，39.2mmol)。加完后，将混合物在室温下搅拌4小时。将混合物倒入冰水(100ml)中并搅拌30分钟。逐滴加入氢氧化钠水溶液(1mol/l)直至ph＝9.过滤混合物。将滤饼用水(5ml
×
2)和叔丁基甲基醚(5ml
×
2)洗涤。收集固体并干燥，得到标题化合物xvii(3.2g，收率95％)，为白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ:10.21(s,1h),8.94(s,1h),8.47(s,1h),7.31(s,1h),4.08(s,3h).
[0240]
step-5 6-溴-4-甲氧基吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲醛肟(xviii)的合成:
[0241][0242]
将6-溴-4-甲氧基吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲醛(xvii)(3.2g，12.5mmol)在乙醇(80ml)中溶解，搅拌10分钟。加入水(40ml)和盐酸羟胺(1.3g，18.8mmol)。将混合物在55℃下搅拌4小时。浓缩混合物以除去乙醇。过滤残余物。将滤饼用水(5ml
×
3)和叔丁基甲基醚(5ml
×
3)洗涤。收集固体并干燥，得到标题化合物xviii(2.8g，收率83％)，为灰白色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ：11.42(br s,1h),8.74(s,1h),8.69(s,1h),7.96(s,1h),7.01(s,1h),4.03(s,3h).
[0243]
step-6 6-溴-4-甲氧基吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲腈(i-1)的合成:
[0244][0245]
将6-溴-4-甲氧基吡唑并[1,5-a]吡啶-3-甲醛肟(xvii)(2.8g，10.4mmol)与乙酸酐(90ml)的悬浮液在120℃下搅拌过夜。冷却混合物并浓缩，得到残余物。将残余物用(石油醚：乙酸乙酯＝1:1,5ml)研磨并过滤。收集固体并干燥，得到标题化合物(i-1,2.38g，收率91％)，为灰色固体。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ：8.95(s,1h),8.60(s,1h),7.25(s,1h),4.04(s,3h).
[0246]
step-7 4-(5-甲基-4-(三甲基甲硅烷基)乙炔基)吡啶-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(xxi-1)的合成:
[0247][0248]
将4-(4-碘-5-甲基吡啶-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(xix-1)(3.3g，8.19mmol)，乙炔基三甲基硅烷(0.96g，9.83mmol)和三乙胺(1.65g，16,14mmol)溶解于四氢呋喃(30ml)溶液中，后加入碘化铜(i)(78mg，0.41mmol)，加入双(三苯基膦)氯化钯(ii)(287mg，0.41mmol)。在氮气下于40℃搅拌2天后，将混合物冷却并倒入水(50ml)中。用乙酸乙酯(30ml
×
2)萃取混合物。将合并的有机层用盐水(20ml)洗涤，用na2so4干燥并浓缩，得到残余物。将残渣用硅胶柱色谱法(石油醚：乙酸乙酯＝20：1)精制，得到褐色固体的标题化合物xxi-1(2.80g，收率92％)。1h nmr(300mhz,cdcl3)δ:8.03(s,1h),6.69(s,1h),3.53-3.51(m,4h),3.47
–
3.43(m,4h),2.25(s,3h),1.48(s,9h),0.26(s,9h).
[0249]
step-8 4-(4-乙炔基-5-甲基吡啶-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(xxii-1)的合成:
[0250][0251]
往4-(5-甲基-4-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)吡啶-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(xxi-1,2.6g，6.95mmol)的甲醇(50ml)混合物中加入碳酸钾(4.8g，6.95mmol)。在室温下搅拌过夜后，过滤混合物。浓缩滤液，得到残余物。将残余物用水(30ml)稀释，并用乙酸乙酯(30ml
×
2)萃取。将合并的有机层用盐水(20ml)洗涤，用na2so4干燥并浓缩，得到残余物。将残余物用石油醚(20ml)研磨并过滤。将滤饼干燥，得到标题化合物(xxii-1,1.42g，产率68％)，为棕色固体。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.05(s,1h),6.73(s,1h),3.53-3.44(m,8h),3.33(s,1h),2.27(s,3h),1.48(s,9h).
[0252]
step-9 6-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-4-((5-甲基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-4-基)乙炔基)吡唑并[1,5-a]吡啶-3-腈(2)合成:
[0253][0254]
将3-氰基-6-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)吡唑并[1,5-a]吡啶-4-基三氟甲磺酸酯(v-1,1.11g，2.99mmol)，叔丁基4-(4-乙炔基-5-甲基吡啶-2-基)哌嗪-1-羧酸丁酯(xvii-1,0.90g，2.99mmol)，碘化铜(57mg，0.30mmol)和n,n-二异丙基乙胺(772mg，5.99mmol)悬浮于n,n-二甲基乙酰胺(15ml)中，再加入双(三苯基膦)氯化钯(ii)(210mg，0.30mmol)。在100℃和氮气下搅拌5小时后，将混合物冷却并倒入水(50ml)中。加入二氯甲烷(50ml
×
3)以萃取所需化合物。将合并的有机层用水(20ml)，盐水(20ml)洗涤，用na2so4干燥并浓缩，得到残余物。将残余物用石油醚(30ml)研磨并过滤，得到粗产物(1.1g，粗品)。将粗产物用甲醇(5ml)进一步研磨并过滤，得到key intermediate-2(920mg，收率59％)，为黄色固体。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.63(d,j＝1.2hz,1h),8.29(s,1h),8.10(s,1h),7.80(s,1h),7.71(d,j＝1.2hz,2h),7.21(s,1h),4.00(s,3h),3.54-3.52(m,8h),2.41(s,3h),1.49(s,9h).
[0255]
在key intermediate-2(900mg,1.72mmol)的二氯甲烷(20ml)混合物中加入三氟乙酸(5ml)。在室温下搅拌1小时后，浓缩混合物，得到残余物。残余物用二氯甲烷(100ml)稀释，再用碳酸氢钠饱和水溶液(50ml)洗涤。水层用二氯甲烷(50ml
×
2)萃取。浓缩合并的有机相，再得到残余物。将此残余物溶于(二氯甲烷：甲醇＝2：1,100ml)中。加入甲醛水溶液(37％，0.5ml)。在室温下搅拌30分钟后，分批加入氰基硼氢化钠(325mg，5.16mmol)。混合物在室温下搅拌过夜。将混合物倒入水(30ml)中，并用二氯甲烷萃取(100ml
×
2)。浓缩合并的
有机相，得到残余物。残余物用甲醇(5ml)研磨，过滤得到标题化合物(620mg，产率83％)，纯度为95％的黄色固体。产物用(氯仿：甲醇＝1：1,15ml)重结晶，得到标题化合物2(500mg，产率67％)，纯度96％的黄色固体。将产物从(氯仿：甲醇＝3：1,15ml)中重结晶，得到97.3％纯度(230mg，收率31％)的黄色固体。lc-ms[mobile phase:from 80％water(0.02％ nh4oac)and 20％ ch3cn to 30％water(0.02％ nh4oac)and 70％ ch3cn in 6.5min],rt＝3.552min；purity:97.35％(214nm),97.28％(254nm)；ms calcd:436.2；ms found:437.2[m+h]+.1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.63(d,j＝1.2hz,1h),8.28(s,1h),8.10(s,1h),7.80(s,1h),7.71(s,2h),7.20(s,1h),4.00(s,3h),3.56(t,j＝5.2hz,4h),2.53(t,j＝5.2hz,4h),2.40(s,3h),2.34(s,3h).
[0256]
实施例_3-183
[0257]
根据实施例1或者实施例2的方法，只要变换适当的起始原材料、合适的相应中间体，即可以合成出广泛的各种各样的衍生物。实施例3-183是其中的一些代表性的示例化合物(见表1)。
[0258]
表1通式ⅰ中的代表性的化合物
[0259]
[0260]
[0261]
[0262]
[0263]
[0264]
[0265]
[0266]
[0267]
[0268]
[0269]
[0270]
[0271]
[0272]
[0273]
[0274]
[0275]
[0276]
[0277]
[0278]
[0279]
[0280]
[0281]
[0282]
[0283]
[0284]
[0285]
[0286]
[0287]
[0288]
[0289]
[0290]
[0291]
[0292]
[0293]
[0294]
[0295]
[0296]
[0297]
[0298]
[0299]
[0300]
[0301][0302]
另外，参考实施例1或和实施例2的方法，只要适当选择起始原材料，还可以合成出更加广泛的各种各样的衍生物。例如表2所列的化合物就是其中的一些典型的示例化合物。
[0303]
表2通式ⅰ中的比较典型的化合物
[0304]
[0305]
[0306]
[0307]
[0308]
[0309]
[0310]
[0311]
[0312]
[0313][0314]
实施例_241生物实验和药效学分析
[0315]
一、激酶活性的检测
[0316]
激酶活性的测试有较多的文献报道，同时也有相关的激酶检测试剂盒可供使用。可选择来源于cisbio公司产品但不限于：htrf kinease-stk kit。以htrf(均相时间分辨荧光)激酶检测试剂盒对ntrk激酶抑制活性的检测为例，实验操作步骤如下：
[0317]
1.实验方法与步骤：
[0318]
1.1将待测化合物配制成10mm(mmol/l)的dmso溶液。
[0319]
1.2将10mm浓度的化合物用激酶缓冲液(kinase buffer)稀释为2.5μm(2.5
×
化合物)工作液，然后以2.5μm为最高浓度，按3倍梯度稀释，将待测化合物2.5
×
工作液连续稀释到9个浓度，浓度分别为：2.5、0.833333、0.277778、0.092593、0.030864、0.010288、0.003429、0.001143、0.000381μm；将10mm对照化合物用kinase buffer稀释为2.5μm工作液，然后以2.5μm为最高浓度，按3倍梯度稀释，将待测化合物2.5
×
工作液连续稀释到9个浓度，浓度分别为：2.5、0.833333、0.277778、0.092593、0.030864、0.010288、0.003429、0.001143、0.000381μm。
[0320]
1.3取4μl的2.5
×
化合物工作液加入到384孔板中(greiner，cat#781280),设置blank孔(不加化合物与激酶)、control孔(只加激酶不加化合物)，在blank和control孔加入4μl kinase buffer。
[0321]
1.4将激酶存储液用kinase buffer配制成相应5
×
工作液，取2μl的5
×
激酶工作液加入含有化合物工作液的各孔中，在blank孔加入2μl kinase buffer，在control孔加入2μl 5
×
激酶工作液。
[0322]
1.5取2μl的5
×
底物储存液(tk antibody-cryptate)加入含有化合物和激酶工作液的各孔中，在blank孔加入2μl kinase buffer，在control孔加入2μl 5
×
底物储存液。
[0323]
1.6取2μl的atp工作液(5
×
)加入各检测孔中。
[0324]
1.7将384孔板贴上封膜37℃孵育1小时，随后各孔加入5μl(4x)反应终止液(streptavidin-xl665)；
[0325]
1.8继续将384孔板贴上封膜，37℃孵育1小时后，在2104envision读板器上检测665、620信号值。
[0326]
检测体系工作液配制：
[0327]
[0328][0329]
2.数据分析：
[0330]
用下列公式来计算检测化合物的抑制率(inhibition rate，ir)：ir(％)＝(rlu ctr(665/620)
–
rlu化合物(665/620))/(rlu ctr(665/620)
–
rlu blank(665/620))*100％。在excel中计算不同浓度化合物的抑制率，然后用graphpad prism 5软件计算出ic
50
。
[0331]
3.trka、trkb、trkc激酶的活性抑制检测结果
[0332]
部分生物活性测试结果见表3
[0333]
表3化合物对激酶抑制活性
[0334]
化合物trka ic
50
(μm)trkb ic
50
(μm)trkc ic
50
(μm)10.0980.0190.15520.0490.0100.34130.0200.0140.784
[0335]
同样，还做了其他化合物对trka、trkb、trkc激酶的活性抑制，显示抑制效果较好。
[0336]
同时，本发明的化合物对其他的激酶，如trk、ret、raf、fghr、pdgfr、vegfr等各种激酶，均有明显的抑制效果。
[0337]
实施例_242_肿瘤细胞抑制活性gi
50
值的测定
[0338]
细胞活性测试采用ctg(cell titer-glo)发光法来测试目标化合物的活性。其原理为：atp腺嘌呤核苷三磷酸(简称三磷酸腺苷)参与生物体内多种酶促反应，是活细胞新陈代谢的一个指标，其含量直接反应了细胞的数量及细胞状态，实验过程中向细胞培养基加入等体积celltiter-glo
tm
试剂，测量发光值，在光信号和体系中，发光值与atp量成正比，而atp又和活细胞数正相关，与抗肿瘤药物的活性成反比，可通过检测atp的荧光信号，即可根据计算公式得到化合物对肿瘤细胞的抗增殖活性数据。
[0339]
肿瘤细胞抑制活性的测试分二部分进行：以激酶为靶点，检查目标化合物对人甲状腺导管癌细胞(tt)、人结肠癌细胞(km12)；为确定对ntrk fusion的活性，有针对性地检测目标化合物对ntrk融合细胞的生长抑制活性。
[0340]
实验所用试剂：f-12k基础培养基(atcc，30-2004)，胎牛血清(corning，35-076-cv)，双抗(gibco，15240-062)，胰酶(gibco，25200072)，dmso(sigma，d2650)，dmem基础培养基(corning，10-013-cv)，胎牛血清(gibco，10091-148)。
[0341]
1、化合物对人甲状腺导管癌细胞与人结肠癌细胞活性测定
[0342]
以下方法用于测定化合物对肿瘤细胞增殖的影响通过采用ctg发光法来进行测
定。
[0343]
具体实验操作方法与流程：
[0344]
1.1、细胞复苏：
[0345]
从液氮保存罐中将冻存的细胞，立即放入37℃恒温水浴中震荡2min，至细胞冻存液完全融化后，将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心(1000r/min，5min)，弃上清，吸干原液，加5ml上述培养基，轻轻吹打至单细胞悬液，将其转移至培养瓶中，放入培养箱中培养。
[0346]
1.2、细胞培养：
[0347]
将细胞用完全培养基在37℃，5％ co2的培养箱中进行培养。定期传代，取处于对数生长期的细胞用于铺板。
[0348]
1.3、细胞铺板：
[0349]
用台盼蓝进行细胞染色并计算活细胞，将细胞浓度调整至适当中板浓度(tt：50000cell/ml、km12：35000cell/ml)的细胞液，在96孔培养板(corning，3599)中每孔加入90μl细胞悬液，并设置空白对照孔和溶媒对照孔。在空白对照孔加入含细胞的培养液，在溶媒对照孔中加入不含细胞的培养液。随后将培养板放入37℃，5％ co2，及100％相对湿度的培养箱中培养过夜。
[0350]
1.4、化合物配制：
[0351]
称取化合物用dmso配制成10mm的储存液，将待测化合物储备液在配药板(beaver,suzhou)上用无血清培养基稀释至终浓度为100μm的10
×
化合物工作液(包括对照品)。按3倍浓度梯度用无血清培养基稀释，得到9个浓度梯度的10
×
化合物工作液，化合物浓度分别为100、33.33、11.11、3.70、1.23、0.411、0.137、0.046、0.015μm。
[0352]
1.5、化合物的添加
[0353]
将不同浓度梯度的10
×
化合物工作液加入至96孔的细胞培养板中，10μl/孔，在溶媒对照孔和空白对照孔中加入10μl dmso-细胞培养液混合液，dmso终浓度为0.1％，每个浓度设置2个复孔。将96孔细胞板放回37℃，5％二氧化碳培养箱中培养5天。
[0354]
1.6、ctg检测：
[0355]
取出细胞培养板放置30分钟使其平衡至室温，在每孔中加入50μl(等于每孔中细胞培养液一半体积)的celltiter-glo工作液，用铝箔纸包裹细胞板以避光，将培养板在轨道摇床上振摇2分钟以诱导细胞裂解，培养板在室温放置10分钟以稳定发光信号，在2104envision读板器上检测发光信号。
[0356]
1.7、数据分析
[0357]
用下列公式来计算检测化合物的抑制率(inhibition rate，ir)：ir(％)＝(1
–
(rlu化合物
–
rlu空白对照)/(rlu溶媒对照
–
rlu空白对照))*100％，最后利用graphpad prism 5软件中以化合物浓度对数-抑制率进行非线性回归分析，得到化合物抑制细胞增殖的ic
50
值。
[0358]
结果检测结果见表4。
[0359]
表4所得化合物对tt细胞、km12细胞生长抑制活性检测结果
[0360]
[0361]
[0362]
[0363]
[0364]
[0365][0366]
实施例_243化合物对融合肿瘤细胞株活性测定
[0367]
体外抗肿瘤抑制活性除了使用相关的肿瘤细胞株外，还使用ntrk融合工程细胞株，有针对性地检测目标化合物对ntrk fusion的活性。以下方法用于测定化合物对ntrk融合工程细胞增殖的影响，通过采用ctg发光法来进行测定。针对ntrk融合，采用baf3 etv6-ntrk3融合工程细胞株(由precedo公司构建)。按照相应条件培养。
[0368]
实验所用试剂：rpmi-1640基础培养基(gibco，22400-089)，胎牛血清(sh30084.03，sh30084.03)，双抗(gibco，15240-062)，胰酶(gibco，25200072)，dmso(sigma，d2650)。
[0369]
实验操作方法如下：
[0370]
2.1、细胞复苏：
[0371]
从液氮保存罐中将冻存的细胞，立即放入37℃恒温水浴中震荡2min，至细胞冻存液完全融化后，将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心(1000r/min，5min)，弃上清，吸干原液，加5ml上述培养基，轻轻吹打至单细胞悬液，将其转移至培养瓶中，放入培养箱中培养。
[0372]
2.2、细胞培养：
[0373]
将ba/f3-etv6-ntrk3工程细胞用完全培养基(rpmi-1640+10％fbs+1％p/s)在37℃，5％co2的培养箱中进行培养。定期传代，取处于对数生长期的细胞用于铺板。
[0374]
2.3、细胞铺板：
[0375]
用台盼蓝进行细胞染色并计算活细胞，将细胞浓度调整至30000cell/ml的细胞液，在96孔培养板(corning，3599)中每孔加入90μl细胞悬液，并设置空白对照孔和溶媒对照孔。在空白对照孔加入含细胞的培养液，在溶媒对照孔中加入不含细胞的培养液。随后将培养板放入37℃，5％co2，及100％相对湿度的培养箱中培养过夜。
[0376]
2.4、化合物配制：
[0377]
称取化合物用dmso配制成10mm的储存液，将待测化合物储备液在配药板(beaver,suzhou)上用无血清培养基稀释至终浓度为100μm的10
×
化合物工作液(包括对照品)。按3倍浓度梯度用无血清培养基稀释，得到9个浓度梯度的10
×
化合物工作液，化合物浓度分别为100、33.33、11.11、3.70、1.23、0.411、0.137、0.046、0.015μm。
[0378]
2.5、化合物的添加：
[0379]
将不同浓度梯度的10
×
化合物工作液加入至96孔的细胞培养板中，10μl/孔，在溶媒对照孔和空白对照孔中加入10μl dmso-细胞培养液混合液，dmso终浓度为0.1％，每个浓度设置2个复孔。将96孔细胞板放回37℃，5％二氧化碳培养箱中培养5天。
[0380]
2.6、ctg检测：
[0381]
取出细胞培养板放置30分钟使其平衡至室温，在每孔中加入50μl(等于每孔中细胞培养液一半体积)的celltiter-glo工作液，用铝箔纸包裹细胞板以避光，将培养板在轨
道摇床上振摇2分钟以诱导细胞裂解，培养板在室温放置10分钟以稳定发光信号，在2104 en vision读板器上检测发光信号。
[0382]
2.7、数据分析：
[0383]
用下列公式来计算检测化合物的抑制率(inhibition rate，ir)：ir(％)＝(1
–
(rlu化合物
–
rlu空白对照)/(rlu溶媒对照
–
rlu空白对照))*100％，最后利用graphpad prism5软件中以化合物浓度对数-抑制率进行非线性回归分析，得到化合物抑制细胞增殖的ic
50
值。
[0384]
结果检测结果见表5。
[0385]
表5所得化合物对融合肿瘤细胞生长抑制活性检测结果
[0386]
[0387][0388]
结果显示，目标化合物对ntrk fusion有明显的抑制活性。其余部分化合物数据未提供，但其均有较为显著的抑制效果。
[0389]
实施例_244本发明化合物的体内抗肿瘤活性:
[0390]
选择体外活性强，低毒的部分化合物用来测定在小鼠体内的最大耐受剂量(mtd)。本发明的化合物在体内的抗肿瘤活性是在人癌裸鼠异体移植肿瘤的模型上进行测定的，探索受试化合物产生药效作用的给药剂量、给药途径、给药频率和周期。
[0391]
取5-6周龄雌性balb/c裸鼠，体重约18-20克，饲养。
[0392]
细胞皮下同种移植瘤在balb/c裸小鼠模型体内药效，并进行药效评估。
[0393]
建造人癌裸鼠异体移植性肿瘤模型：tt(人甲状腺癌细胞)培养，将单层培养的肿瘤细胞消化脱壁后，收集并重悬于不含血清的培养液，调整到浓度5
×
106/0.2ml，放于冰盒中携至动物房，直接用带6号针头的注射器取0.2ml细胞悬液移植于裸鼠左腋窝后方肩胛部皮下，5
×
106/0.2ml/只，每2-3天测一次成瘤体积，选择肿瘤生长旺盛且无溃破的荷瘤裸鼠，在无菌条件下，取出肿瘤，将瘤组织剪成直径约2-3mm接种于裸鼠左腋窝后方肩胛部皮下，传三代后，当肿瘤体积生长至100-150mm3时去掉瘤块过大或过小的裸鼠随机分组给药。
[0394]
随机分5个组，包括阴性对照组(溶媒)，阳性对照组(blu-667,10mg/kg)，高中低三个剂量的治疗组(分别为5mg/kg,10mg/kg,40mg/kg，其中高剂量低于mtd)，每组5只裸鼠，腹腔注射给药，每天两次，连续3周。期间每3天检测动物体重，瘤体积并记录动物死亡数。末次给药后24小时处死动物，测量肿瘤体积大小、瘤重、裸鼠体重，绘制肿瘤体积生长曲线、裸鼠体重生长曲线和肿瘤抑制率，动物死亡率，计算相对肿瘤增殖率t/c(％)，根据公式t/c(％)
＝trtv/crtv*100％。(trtv：治疗组rtv；crtv：阴性对照组rtv，相对肿瘤体积rtv＝vt/v0，其中v0为分组给药时肿瘤体积，vt为给药后肿瘤体积)。本发明之化合物的体内抗肿瘤药效的相对肿瘤增殖率t/c(％)≤40％，tgi％均大于80％(见：图1化合物171在tt模型的体内抗肿瘤活性)。并且差异有统计学意义，具有明显药效作用表现出了良好的体内抑瘤效果。于此同时，本发明化合物171的不同剂量组的动物体重无明显下降，显示出良好的耐受性。
[0395]
本实验中。评价了化合物171对tt细胞异种移植瘤模型中的体内药效，同时以blu-667为作为对照。实验结果显示，化合物171以30mg/kg的剂量灌胃，t/c小于40％，表现出了良好的体内抑瘤效果。同样，其他化合物也具有相似的体内抑制肿瘤效果。
[0396]
体内抗肿瘤抑制活性除了使用相关的肿瘤细胞株外，还要使用相关的工程株，例如kif5b-ret融合肿瘤细胞株。
[0397]
说明于本发明的特定实例的细节并非用于被推断为其限制。可在不背离本发明的本质及范围的情况下进行各种改变、同义及修饰，且已知这些改变、同义及修饰的具体实施方案是本发明之一部份。