一种志贺菌属核酸分子的检测方法及试剂盒与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种志贺菌属核酸分子的检测方法及试剂盒。


背景技术：

2.argonaute(ago)蛋白质是一种可编程核酸酶,广泛分布于真核生物和原核生物。真核生物ago蛋白质在rna干扰途径中起关键作用,能够在小rna或者小dna的引导下识别甚至切割与之互补的rna。原核生物ago蛋白质可能参与宿主防御和dna复制,偏爱在小dna的引导下切割与之互补的dna。基于这些特性，ago蛋白质能够在核酸检测和遗传操作等方面得以应用。
3.慢性便秘(cc)是一种常见的多因素疾病，其特征是排便减少、大便硬和大便过度紧张。一些慢性便秘患者可以治愈，然而大约三分之一的慢性转移性功能性便秘患者(fc)对治疗没有反应并反复发作，这种医学上难治性慢运输型便秘被认为是结肠切除术的并发症(stc)，而这种病又称为对常规药物无效的顽固性功能性便秘(ifc)。到目前为止，已经确定了与难治性慢运输型便秘相关的几个因素，特别是，最近的全基因组分析和粪便移植表明，肠道微生物志贺菌属(shigella sp.variant)可能是影响肠道转运和慢性便秘表型的重要因素。
4.人体肠道中存在的数量庞大的微生物，这群微生物依靠人体的肠道生活，同时帮助人体完成多种生理生化功能。肠道微生物不仅在膳食和宿主之间起到了重要的桥梁作用，其本身以及代谢产物也能调节人体健康，因此肠道微生物与人体健康密切相关。因此，基于原核argonaute蛋白开发一种灵敏度高、特异性好、快速高效的志贺菌属核酸检测方法是非常有必要的。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种用于检测志贺菌属核酸分子的方法及试剂盒，以提高志贺菌属核酸分子的检测灵敏度。
7.本发明是这样实现的：
8.本发明提供了一种志贺菌属核酸分子的检测方法，其包括利用argonaute蛋白的特性，初级向导ssdnas介导argonaute蛋白剪切靶标dna后，断裂产生的次级向导ssdna再次被argonaute蛋白利用去剪切与次级向导ssdna互补的荧光报告核酸；
9.上述靶标dna的序列如seq id no.1所示。
10.在一些实施方式中，argonaute蛋白是以dna为向导指导剪切靶标dna的中等温度argonaute蛋白。
11.在一些实施方式中，中等温度argonaute蛋白包括blago酶。
12.在一些实施方式中，blago酶的工作温度为36-38℃。
13.在一些实施方式中，靶标dna在检测体系中的浓度为≥1拷贝/微升。
14.在一些实施方式中，靶标dna在检测体系中的浓度为≥4拷贝/微升。
15.在一些实施方式中，靶标dna在检测体系中的浓度为≥10拷贝/微升。
16.在一些实施方式中，初级向导ssdnas与靶标dna互补配对，其包括初级向导ssdna a链和初级向导ssdna b链。
17.初级向导ssdna a链的核苷酸序列如seq id no.2所示；
18.初级向导ssdna b链的核苷酸序列如seq id no.3所示。
19.在一些实施方式中，初级向导ssdnas为5
’‑
磷酸化的单链dna分子。
20.在一些实施方式中，初级向导ssdnas的长度为18-25nt。
21.在一些实施方式中，靶标dna和argonaute蛋白与初级向导ssdnas在检测体系中的摩尔比为8:60:1-40:600:1。
22.在一些实施方式中，次级向导ssdna的长度为10-25nt。
23.在一些实施方式中，荧光报告核酸的长度为25-50nt。
24.在一些实施方式中，荧光报告核酸在检测体系中的浓度为200-1000nm。
25.在一些实施方式中，靶标dna与荧光报告核酸的摩尔比为：102：1至2
×
105：1；优选地，靶标dna与荧光报告核酸的摩尔比102：1至2
×
103：1。
26.本发明还提供了一种用于检测志贺菌属核酸分子的试剂盒，其包括上述方法中采用的argonaute蛋白、初级向导ssdnas和荧光报告核酸。
27.本发明具有以下有益效果：
28.本发明利用以dna为向导指导剪切靶标dna的argonaute蛋白的特性：即在首次由初级向导ssdna(guide ssdna)介导剪切后，在合适的反应温度下，断裂的5’核酸片段可再次被argonaute蛋白利用去剪切与之互补的荧光报告核酸链，通过荧光报告核酸断裂产生的荧光信号检测样本中志贺菌属核酸含量。检测结果表明，该检测方法在现有技术的基础上有更好的灵敏性和重复性。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
30.图1为实验例中两种方法的检测结果对比：a为rt-qpcr试剂盒分别对反应体系中0拷贝至1000拷贝靶基因的检测结果，数据来自九次重复实验；b为blago介导的核酸检测方法分别对反应体系中0拷贝至1000拷贝靶基因的检测结果，数据来自九次重复实验。
具体实施方式
31.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
32.argonautes是一种核酸酶，其普遍存在于细菌、植物、真菌、哺乳细胞内。其除了参与rna干扰机制，某些物种的argonaute还可作为dna核酸内切酶。
33.中等温度argonaute蛋白(ago酶)包括brevibacillus laterosporus(blago)、clostridiumbutyricum(cbago)、intestinibacter bartlettii(ibago)及其突变体，通过cbago的系统进化树分析，我们从嗜温细菌中发现了brevibacillus laterosporus(blago)，并研究了它们在广泛条件下切割ssdna和dsdna的生化特性。其中blago酶切特性为：该酶能够在中等温度条件下利用5’磷酸化或羟基化的寡聚核苷酸作为向导ssdna指导该酶对靶标dna序列的精确剪切；剪切位点位于与向导ssdna的第10与11位核苷酸对应的靶标dna(ssdna)之间的磷酸二酯键。
34.目前已知的blaao会产生一种独特的独木舟状板层体附于孢子一侧，该物种的全基因测序揭示其能产生多酮物质，以此blaao成为生物防治虫害的热门菌种。还未有相关报道证明blaao具有切割ssdna和dsdna的生化特性。
35.基于此，本发明首次开发了一种针对shigella sp.variant 16srna的操作简便、兼容性好的核酸检测方法。本发明方法利用以dna为向导指导剪切靶标dna的blago酶的特性，即在首次由初级向导ssdna(guide ssdna)介导剪切后，在合适的反应温度下，断裂的5’核酸片段可再次被blago酶利用去剪切与之互补的荧光报告核酸链。
36.在本发明中，靶标dna来源于shigella sp.variant特异性16s rrna，位于山梨糖醇脱氢酶基因上的snp，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
37.seq id no.1：
[0038]5’‑
gcaaatataacatctgcccgaacgttgattttatggcgacacaacctaactaccgcggcgcattaacgcactatctgtgtcatccggagagctttacttacaaactgcccgacaatatggacacgatggaaggggcgctggtggagcctgccgcagtcgggatgcatgccgcgatgctggcagatgttaaaccgggtaagaagataattattctgggagcgggttgtattggtttgatgacgttgcaagc-3’。
[0039]
在一些实施例中，向导ssdna对包括初级向导ssdna和次级向导ssdna。
[0040]
初级向导ssdnas与靶标dna互补配对，由初级向导ssdnas引导blago酶的特异性切割，产生次级向导ssdna及另外两段单链dna。
[0041]
在一些实施例中，初级向导ssdna可以一对或多对。
[0042]
在一些实施例中，初级向导ssdnas为5
’‑
磷酸化的单链dna分子。
[0043]
在一些实施例中，所述初级向导ssdnas的长度为18-30nt。
[0044]
在一些实施例中，初级向导ssdna包括初级向导ssdna a链和初级向导ssdnab链；初级向导ssdna a链的核苷酸序列如seq id no.2所示；初级向导ssdna b链的核苷酸序列如seq id no.3所示。
[0045]
seq id no.2：
[0046]5’
p-aggctccaccatcgccccttccatcg 3’；
[0047]
seq id no.3：
[0048]5’
p-actgcggcaggctccaccagcgcc 3’。
[0049]
由上述初级向导ssdnas引导blago酶的特异性切割，产生次级向导ssdna，其长度为10-20nt。次级向导ssdna的序列如seq id no.4所示。
[0050]
seq id no.4：
[0051]5’‑
gcgctggtggagcct-3’。
[0052]
次级向导ssdna与荧光报告核酸的序列互补结合后，引导blago酶对荧光报告核酸进行切割，从而产生可检测的信号。
[0053]
在一些实施例中，与次级向导ssdna互补的荧光报告核酸的长度为20-30nt。
[0054]
在一些实施例中，报告分子是荧光分子或荧光基团。报告核酸分子是分别携带荧光基团和淬灭基团的核酸分子。其中，在5’端标记荧光基团(f)，3’端标记淬灭基团(q)。
[0055]
在一些实施例中，荧光报告核酸的序列如seq id no.5所示。
[0056]
seq id no.5：
[0057]3’
f-agcgacttgacgcgaccacctcggagtgc-q 5’。
[0058]
在一些实施例中，靶标dna在检测体系中的浓度为≥1拷贝/微升。
[0059]
在一些实施例中，靶标dna在检测体系中的浓度为≥4拷贝/微升。
[0060]
在一些实施例中，靶标dna、argonaute蛋白、初级向导ssdnas在检测体系中的摩尔比为8:60:1-40:600:1。
[0061]
在一些实施例中，荧光报告核酸在检测体系中的浓度为：200-1000nm。
[0062]
在一些实施例中，靶标dna与荧光报告核酸的摩尔比为：102：1至105：1；优选地，靶标dna与荧光报告核酸的摩尔比102：1至103：1。
[0063]
在一些实施例中，上述检测方法是体外方法。
[0064]
在一些实施例中，上述检测方法是非诊断性和非治疗性的。
[0065]
本发明还提供了一种用于检测志贺菌属核酸分子的试剂盒，其包括上述方法中采用的argonaute蛋白、初级向导ssdnas和荧光报告核酸。
[0066]
上述试剂盒的使用方法如下:
[0067]
1、获取的待检样本作为模板加入pcr体系中对其进行扩增，获得靶标dna；
[0068]
2、加入特异性的寡核苷酸向导ssdnas、与之相应的荧光报告核酸及blago酶在36-38℃持续保温的条件下进行特异性剪切，并对荧光信号进行采集；
[0069]
3、分析荧光信号值，调节baseline的start值、end值和阈值线，判定结果。
[0070]
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0071]
实施例1
[0072]
本实施例提供了一种用于检测志贺菌属核酸分子的方法。
[0073]
其中，检测试剂包括：
[0074]
(1)初级向导ssdna，包括初级向导ssdna a链和初级向导ssdnab链；初级向导ssdna a链的核苷酸序列如下：
[0075]5’
p-aggctccaccatcgccccttccatcg 3’；
[0076]
初级向导ssdna b链的核苷酸序列如下：
[0077]5’
p-actgcggcaggctccaccagcgcc 3’。
[0078]
(2)荧光报告核酸，其序列如下：
[0079]3’
f-agcgacttgacgcgaccacctcggagtgc-q 5’。
[0080]
(3)blago酶。
[0081]
(4)反转录引物为：oligo(dt)
[0082]
(5)反转录反应酶及缓冲液：2
×
es reaction mix。
[0083]
(6)dntp。
[0084]
(7)小鼠rnase抑制剂。
[0085]
(8)mgcl2溶液。
[0086]
检测方法如下：
[0087]
(1)将初级向导ssdna、荧光报告核酸以及blago酶用超纯水配制成浓度为10μm的溶液；反转录引物r-primer干粉用超纯水溶解制成2μm的溶液。
[0088]
(2)获取的待检样本作为模板加入pcr体系中对其进行扩增，获得靶标dna；扩增体系为：5μl rna、10μl 2
×
es reaction mix和1μl oligo(dt)最后定容到20μl体积。
[0089]
(3)加入特异性的寡核苷酸向导ssdnas、与之相应的荧光报告核酸及blago酶在37℃持续保温的条件下反应2h，进行特异性剪切，并对荧光信号进行采集，每分钟检测一次荧光信号。其中向导ssdnas、荧光报告核酸及blago酶的使用量分别为0.27mm、0.625nm、40.5nm；
[0090]
具体地，将靶标dna与反转录引物r-primer、dntp、protoscript ii rt、5
×
protoscript ii buffer、dtt、小鼠rnase抑制剂、blago酶、mgcl2、初级向导ssdna a链b链、荧光报告核酸、rnase-free双蒸水混合，配置成30μl体系。该体系为：r-primer终浓度为400nm，dntp终浓度为1mm，protoscriptii rt 200u，小鼠rnase抑制剂8u，dtt终浓度为100mm，mgcl2终浓度为0.83mm，荧光报告核酸终浓度为0.27mm，靶标核酸分子终浓度分别为5nm、12.5nm、25nm、50nm、125nm、250nm、500nm，靶标核酸分子与blago与向导ssdnas的终浓度摩尔比40：324：5。
[0091]
(4)分析荧光信号值，调节baseline的start值、end值和阈值线，判定结果。
[0092]
对比例
[0093]
本对比例是采用rt-qpcr检测方法志贺菌属核酸分子，具体操作步骤如下：
[0094]
其中，检测试剂包括：
[0095]
(1)2
ꢀ×ꢀ
hsybr qpcr mix 5 μl
[0096]
(2)dna模板(1-10 ng cdna)2 μl
[0097]
(3)primer-f、primer-r(10 μm)各0.4 μl
[0098]
(4)rnase-free water 2.2μl
[0099]
pcr程序为：
[0100]
(1)95 ℃ 10 min
[0101]
(2)95 ℃ 15 s,55 ℃ 30s 72℃ for 30s，42个循环
[0102]
(3)4℃ 10min
[0103]
实验例
[0104]
实施例与对比例的检测结果如图1所示。其中a为rt-qpcr试剂盒分别对反应体系中0拷贝至1000拷贝靶基因的检测结果，数据来自九次重复实验；b为blago介导的核酸检测方法分别对反应体系中0拷贝至1000拷贝靶基因的检测结果，数据来自九次重复实验。
[0105]
从图1中可以看出，当反应体系中核酸浓度大于等于100拷贝时两种方法均能有效地检测出目标核酸。
[0106]
当反应体系中核酸浓度为10拷贝时，rt-qpcr试剂盒的九次重复中只有三次的实验结果的ct值小于37，当反应体系中核酸浓度为8拷贝或者4拷贝时，相应地ct值或者为0或
者大于38，表明此时已无法准确检测该浓度的核酸样本。
[0107]
而blago介导的核酸检测方法可以准确检测出反应体系中含有8拷贝或者4拷贝的核酸样品，荧光信号的强度均高于阴性对照，在反应体系中只含有1拷贝的核酸样品时，九次重复中有四次实验检测到高于阴性对照的荧光信号，表明blago介导的核酸检测方法的检测下限可以达到1拷贝每反应。
[0108]
因此相比于rt-qpcr，blago介导的核酸检测方法在检测极低浓度的核酸时具有更高的灵敏度和稳定性。
[0109]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。