一种胶原蛋白基水凝胶的制备方法及其用途与流程

本发明涉及一种胶原蛋白基水凝胶的制备方法及其用途，属于生物材料。

背景技术：

1、水凝胶的三维结构与天然的细胞外基质十分相似，广泛应用于组织粘合剂、创伤止血、药物缓释，创面修复等领域。在早期应用于再生医学的水凝胶研究中，由戊二醛交联的pva和壳聚糖、光交联甲基丙烯酸酯明胶以及和转谷氨酰胺酶交联纤维蛋白原等不可逆共价交联水凝胶占主导地位(bioact.mater.，2021，6(5)：1375.)。然而，不可逆共价交联水凝胶是稳定的，缺乏细胞增殖、细胞外基质重塑和其他细胞行为所必需的动力学。因此，研究人员将他们的注意力转向细胞可降解聚合物，这种聚合物可以调节细胞增殖和组织再生(nat.commun.,2021,10；12(1):3514.)然而，水凝胶降解会引起其机械损失，无法3d细胞培养提供足够的力学支撑。

2、近几十年来，具有动态可逆交联的水凝胶已经能够模拟天然细胞外基质的动态变化。天然细胞外基质是动态的，具有应力松弛和重塑，并为细胞提供动态力学。然而，具有不可逆共价交联的水凝胶相对是静态的，其应力松弛有限，不利于细胞增殖。多重物理和动态共价化学可以制备出具有自修复、剪切稀化和快速应力松弛等特性的超动态水凝胶，以提供动态物理线索，有利于细胞快速增殖。

3、胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，胶原水凝胶因与软组织性能相似且能够生物降解，是一类潜在利用价值高的再生医学生物材料。但是，胶原水凝胶力学性能差、降解速度快、功能单一，已很难满足现代高性能生物医用材料的要求。为了改善胶原水凝胶的力学性能差的问题，目前主要的策略是和其他高分子共混方法获取物理型胶原水凝胶以及通过化学交联剂(碳化二亚胺、戊二醛)形成不可逆化学交联胶原水凝胶。对于物理型胶原水凝胶通过分子间弱的相互作用力，容易遭受外界外力的破坏，而不可逆化学交联胶原水凝胶网络交联稳定，力学性能得到明显提高，但网络束缚失去动态变化，不利于模拟细胞外基质(ecm)的生物物理和生化特性，更好地支持细胞的长期自我更新。因此，以现有的技术制备胶原水凝胶仍然存在诸多缺陷，无法满足高性能生物医用材料的要求。

技术实现思路

1、基于现有的技术情况，本发明提供一种用于3d细胞培养的胶原蛋白基水凝胶及其制备方法，引入邻苯二酚衍生物和pva到胶原水凝胶中，从而增强胶原水凝胶的力学性能、赋予胶原水凝胶抗菌抗氧化性能，模拟细胞外基质动态特性，进而对细胞进行三维封装，以达到细胞快速增殖的目的，广泛应用于大面积烧伤病人或糖尿病等难愈合创面的修复。

2、一种胶原蛋白基水凝胶的制备方法，其包括如下步骤：

3、s1、将pva加入去离子水中，得到pva水溶液；

4、s2、在所述pva水溶液中加入酸溶液，混匀后，加入胶原，混匀；

5、s3、在步骤s2的产物中加入邻苯二酚衍生物水溶液，混匀后，离心分离，收集沉淀物，经过冷冻-解冻过程，得到所述用于3d细胞培养的胶原蛋白基水凝胶。

6、作为优选方案，所述pva水溶液的浓度为5～15wt.％。

7、作为优选方案，所述酸溶液为浓度为1mol/l的醋酸或盐酸，加入量为pva水溶液体积的0.01～1倍。

8、作为优选方案，所述胶原的加入量为pva质量的1～6％，所述胶原为水母胶原蛋白。

9、作为优选方案，所述邻苯二酚衍生物为原儿茶酚醛、2,3,4-三羟基苯甲醛、2,4,5-三羟基苯甲醛中的至少一种，加入量为pva质量的1～10％。

10、作为优选方案，所述离心分离的转速为1000～3000转/min，离心时间为5～10min。

11、作为优选方案，所述冷冻-解冻过程的循环次数为2～4次，冷冻-解冻过程中，冷冻的温度为-80～-40℃，每次冷冻时间为24h，解冻温度为25℃，每次解冻时间为4～6h。

12、一种由前述的制备方法得到的胶原蛋白基水凝胶。

13、一种如前述的胶原蛋白基水凝胶在培养中的用途。

14、作为优选方案，所述3d细胞包括软骨细胞、脂肪干细胞、成纤维细胞和内皮细胞，所述3d细胞可用于修复难愈合创面的人工皮肤中。

15、胶原蛋白其分子含有大量的氨基，与醛基发生席夫碱反应形成可逆共价键。因此，本发明提出一种用于3d细胞培养的胶原蛋白基水凝胶制备方法，将生物友好型pva、胶原蛋白、带有醛基的邻苯二酚衍生物通过多重物理与可逆共价交联平衡交联策略获得具有优良力学性能、抗菌抗氧化、用于3d细胞培养的超动态胶原蛋白基水凝胶制备方法。超动态水凝胶用于封装细胞，进行3d培养有着独特的优势，能够更好地模拟细胞外基质的生物物理和生化特性，有助于细胞间的接触信息传递，实现细胞快速增殖。

16、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

17、1、本发明所述的方法由pva、胶原、邻苯二酚衍生物利用多重物理与可逆共价键平衡交联策略得到用于封装细胞进行3d培养超动态水凝胶。在超动态水凝胶中引入可逆共价形成局部刚性的网络结构，而不会损害细胞适应性水凝胶网络的动态特性，所获得的动态水凝胶可加快封装的细胞的黏附结构，为细胞提供机械支持和生化线索，实现体外大量扩增。

18、2、本发明所述的所制备的胶原基水凝胶中含有大量的ⅰ型胶原是细胞外基质的主要组成成分，能够促进细胞在水凝胶动态网络中粘附、生长与增殖。

19、3、本方法所制备的胶原基水凝胶结构中可逆交联网络能够起到能量耗散使水凝胶具有优异的力学性能以及结构中含有具有抗菌能力的邻苯二酚衍生物也赋予水凝胶抗菌抗氧化性能，很好解决了胶原水凝胶力学性能差、功能单一等问题。

技术特征：

1.一种胶原蛋白基水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的胶原蛋白基水凝胶的制备方法，其特征在于，所述pva水溶液的浓度为5～15wt.％。

3.如权利要求1所述的胶原蛋白基水凝胶的制备方法，其特征在于，所述酸溶液为浓度为1mol/l的醋酸或盐酸，加入量为pva水溶液体积的0.01～1倍。

4.如权利要求1所述的胶原蛋白基水凝胶的制备方法，其特征在于，所述胶原的加入量为pva质量的1～6％，所述胶原为水母胶原蛋白。

5.如权利要求1所述的胶原蛋白基水凝胶的制备方法，其特征在于，所述邻苯二酚衍生物为原儿茶酚醛、2,3,4-三羟基苯甲醛、2,4,5-三羟基苯甲醛中的至少一种，加入量为pva质量的1～10％。

6.如权利要求1所述的胶原蛋白基水凝胶的制备方法，其特征在于，所述离心分离的转速为1000～3000转/min，离心时间为5～10min。

7.如权利要求1所述的胶原蛋白基水凝胶的制备方法，其特征在于，所述冷冻-解冻过程的循环次数为2～4次，冷冻-解冻过程中，冷冻的温度为-80～-40℃，每次冷冻时间为24h，解冻温度为25℃，每次解冻时间为4～6h。

8.一种由权利要求1所述的制备方法得到的胶原蛋白基水凝胶。

9.一种如权利要求8所述的胶原蛋白基水凝胶在培养中的用途。

10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述3d细胞包括软骨细胞、脂肪干细胞、成纤维细胞和内皮细胞，所述3d细胞可用于修复难愈合创面的人工皮肤中。

技术总结
本发明提供了一种胶原蛋白基水凝胶的制备方法，其包括如下步骤：S1、将PVA加入去离子水中，得到PVA水溶液；S2、在所述PVA水溶液中加入酸溶液，混匀后，加入胶原，混匀；S3、在步骤S2的产物中加入邻苯二酚衍生物，混匀后，离心分离，经过冷冻‑解冻过程，得到所述的胶原蛋白基水凝胶。本发明的有益效果在于：本发明所述的所制备的胶原基水凝胶中含有大量的Ⅰ型胶原是细胞外基质的主要组成成分，能够促进细胞在水凝胶动态网络中粘附、生长与增殖。

技术研发人员：范先谋,李瑾,张培华,王文韬,贺承章
受保护的技术使用者：张培华
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13