一种表达禽4型腺病毒fiber2蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法与流程

1.本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种表达禽4型腺病毒fiber2蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法。


背景技术：

2.禽4型腺病毒(fowl adenoviruses-4，4型腺病毒)会引起家禽心包出现淡黄色透明液体，即肝炎-心包积液综合征(hhs)，同时也会出现如肝脏肿胀、肾脏水肿、尿酸盐沉积等临床症状，其死亡率超过30％。被侵染的宿主食欲不振，免疫力降低，并且腺病毒经常成为混合感染时的条件致病菌，与其他病原菌共同感染时，起到协同作用，加强对家禽的伤害，给农户门带来了不可估量的经济损失。由于我国没有成熟的疫苗，防控禽4型腺病毒成了一大难题。
3.目前，腺病毒的防控是比较困难的，常通风、勤消毒等一般的防控措施虽有一定的效果，但实际作用并不大。如今还没能研究出针对禽4型腺病毒的特效药，主要使用的是对脏器没有损伤的维生素c与维生素k等可以降低禽4型腺病毒造成的损失的药物，但根本上是无法治疗腺病毒的。因此开发多种有效的预防疫苗对家禽的防护具有重要应用价值。
4.cn107475296b公开了一种表达鸡4型腺病毒fiber2基因的重组鸡痘病毒转移载体及其构建方法和应用。所述载体以pmd19t-simple载体为基础，ta克隆位点插入fadv4fiber2基因、lacz基因，以及用于同源重组的鸡痘病毒的基因组复制非必须片段ltyb和rtyb。构建的重组鸡痘病毒转移载体为研制高效的表达鸡4型腺病毒的重组鸡痘病毒基因工程活载体疫苗奠定基础。
5.cn112094824a公开了一种表达禽腺病毒4型截短fiber2蛋白的重组新城疫病毒耐热疫苗株及其制备方法与应用，采用rna病毒的反向遗传操作技术，在转录质粒水平对ndv lasota株(新城疫iv系苗)进行基因改造，首先将其hn基因替换为耐热ts09-c株的hn基因，再将禽腺病毒4型的截短fiber2基因(961-1440bp)插入至其p和m基因之间。将改造后的转录质粒转染宿主细胞，拯救并获得ndv rls-tfib2-c株。该疫苗株具有显著的耐热特性，可极大降低对冷链系统的依赖，节省储运成本和提高疫苗热稳定性。该疫苗株表达的不是完整的fiber2蛋白，只截取了其部分区域，针对性增强了疫苗的免疫保护效果。可用于制备禽安卡拉病、新城疫二联耐热活疫苗。
6.目前国内并无预防禽4型腺病毒的成熟疫苗，而国外发布的疫苗免疫效果并不理想，而亚单位疫苗无法实现批量化生产。因此，研发一种可以防控腺病毒的球虫疫苗对防控禽4型腺病毒具有重要的意义。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种表达fiber2蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法。所述靶向eth_00026625基因的sgrna特异性强，脱靶率
低，与cas9核酸酶配合，可实现在柔嫩艾美耳球虫的eth_00026625基因上插入fiber2基因。本发明还提供一种eth_00026625基因编辑系统，所述eth_00026625基因编辑系统的基因编辑效率高，制备得到的重组球虫载体的基因型可稳定存在，应用价值高。所述重组球虫载体能表达fiber2蛋白和荧光标签蛋白，所述重组球虫载体预期可用于研发同时预防禽4型腺病毒和柔嫩艾美耳球虫的球虫疫苗，其免疫效果更为高效安全。
8.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
9.第一方面，本发明提供一种靶向eth_00026625基因的sgrna，所述靶向eth_00026625基因的sgrna核苷酸序列包括seq id no:1所示的序列。
10.本发明中所述eth_00026625基因的核苷酸序列来自于ncbi。
11.seq id no:1：gcgctaccggctattaaggg。
12.本发明中，所述sgrna靶向eth_00026625基因中的非编码区序列，所述sgrna具有良好的特异性与靶向性，脱靶率低，编辑效率高。
13.第二方面，本发明提供一种eth_00026625基因编辑系统，所述eth_00026625基因编辑系统包括第一方面所述的靶向eth_00026625基因的sgrna。
14.优选地，所述eth_00026625基因编辑系统还包括cas9核酸酶。
15.优选地，所述靶向eth_00026625基因的sgrna与所述含cas9核酸酶的编码序列连接在同一个基因编辑质粒中。
16.优选地，所述eth_00026625基因编辑系统还包括同源重组片段，所述同源重组片段中包括fiber2基因和荧光标签基因的编码序列。
17.本发明中，fiber2蛋白的基因全长1440bp，编码479个氨基酸，大小为49.9kda。fiber2蛋白是由前体蛋白经水解后形成，从n端到c端的结构区域依次是ⅰ(尾区)、ⅱ(柄区)和ⅲ(顶端球区)。fiber2是良好的免疫抗原，有研究报道缺失fiber2蛋白，病毒感染宿主的能力呈直线型降低，fiber2蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
18.本发明中，所述eth_00026625基因编辑系统与同源重组片段的配合，在柔嫩艾美耳球虫的eth_00026625基因中实现fiber2基因的定点插入，避免了非特异性的基因编辑，编辑效率高、脱靶率低。
19.本发明中构建的同源重组片段含有his标签，his标签分子量小，免疫原性低，方便后期蛋白检测。本发明中fiber2基因和荧光标签基因之间插入了间隔序列，间隔序列避免了fiber2蛋白和荧光标签蛋白之间形成融合蛋白，有利于fiber2蛋白发挥免疫学活性。
20.本发明中所述同源重组片段的核苷酸序列如seq id no:3所示。
21.第三方面，本发明提供一种重组球虫载体，所述重组球虫载体含有权利要求1所述的靶向eth_00026625基因的sgrna。
22.优选地，所述重组球虫载体含有第二方面所述的eth_00026625基因编辑系统。
23.本发明中，通过对球虫的eth_00026625基因进行编辑，所述重组球虫载体将突变的基因传递给子代球虫，实现了基因编辑的稳定性及可遗传性，降低了筛选的工作量，应用价值更为广泛。
24.优选地，所述重组球虫载体为经过第二方面所述的eth_00026625基因编辑系统编辑后，在eth_00026625基因中整合了所述fiber2基因和荧光标签基因的编码序列的球虫载体。
25.第四方面，本发明提供了一种第三方面所述的重组球虫载体的构建方法，所述重组球虫载体的构建方法包括：
26.构建基因编辑质粒；
27.构建同源重组片段；
28.将基因编辑质粒和所述同源重组片段导入球虫子孢子中，感染动物；
29.筛选阳性克隆，得到所述重组球虫载体。
30.本发明中，所述构建方法简单，可操作性强，编辑效率高，容易获得稳定性状遗传的虫株。
31.优选地，所述基因编辑质粒的构建方法包括：pcr扩增所述靶向eth_00026625基因的sgrna和cas9的编码序列，并连接所述编码序列，得到含有靶向eth_00026625基因的sgrna和cas9的基因编辑质粒。
32.优选地，所述同源重组片段的构建方法包括：依次将fiber2基因和荧光标签基因按顺序连接得到整体片段，将所述整体片段构建到克隆载体上，得到所述同源重组质粒；
33.以所得同源重组质粒为模板，通过pcr扩增得到仅含5’同源臂、启动子、mic1信号肽序列、fiber2基因、6
×
his、p2a、荧光标签基因和3’同源臂的同源重组片段
34.优选地，所述荧光标签基因包括mcherry荧光蛋白基因。
35.优选地，所述同源重组片段的构建方法还包括测序验证的步骤。
36.优选地，所述导入方法为电转染。
37.优选地，所述球虫包括柔嫩艾美耳球虫。
38.优选地，所述动物包括鸡。
39.优选地，所述筛选阳性克隆的步骤包括：根据荧光标签基因，进行筛选，得到阳性球虫。
40.优选地，所述筛选阳性克隆的步骤还包括将所得阳性球虫口服接种，重复接种后得到稳定表达fiber2蛋白的重组球虫载体。
41.本发明中通过在荧光显微镜下观察荧光即检验阳性后代，使用流式细胞术筛选出阳性后代，然后通过口服接种，重复4-5代后得到稳定表达fiber2蛋白的重组球虫载体。
42.作为本发明的优选技术方案，所述重组球虫载体的构建方法的步骤包括：
43.(1)构建含有靶向eth_00026625基因的sgrna和cas9的基因编辑质粒：
44.pcr扩增所述靶向eth_00026625基因的sgrna和cas9的编码序列，并连接所述编码序列，得到所述含有靶向eth_00026625基因的sgrna和cas9的基因编辑质粒；
45.(2)构建同源重组片段：
46.依次将fiber2基因和荧光标签基因按顺序连接得到整体片段，将所述整体片段构建到克隆载体上，得到所述同源重组质粒；
47.以所得同源重组质粒为模板，通过pcr扩增得到仅含5’同源臂、启动子、mic1部分序列、fiber2基因、6
×
his、p2a、mcherry基因、终止子和3’同源臂的同源重组片段；
48.(3)将所述含有靶向eth_00026625基因的sgrna和cas9的基因编辑质粒和所述同源重组片段通过电转染导入柔嫩艾美耳球虫子孢子中，使用球虫子孢子感染鸡；
49.(4)筛选阳性克隆：
50.基于同源重组片段上的荧光标签基因进行筛选，获得阳性球虫；将所得阳性球虫
经流式细胞术筛选后，口服接种，重复4-5代后得到稳定表达fiber2蛋白的重组球虫载体。
51.步骤(1)和步骤(2)的顺序不受编号限制。
52.第五方面，本发明提供了第三方面所述的重组球虫载体在制备抗4型腺病毒和球虫的疫苗中的应用。
53.第六方面，本发明提供了一种第三方面所述的重组球虫载体的检测方法，所述检测方法包括pcr扩增检测和/或荧光检测。
54.优选地，所述pcr扩增检测的靶点基因包括fiber2基因和/或荧光标签基因；
55.优选地，所述荧光检测包括根据所述重组球虫载体的荧光进行检测。
56.作为本发明的优选技术方案，本发明中对重组球虫载体的检测方法包括：
57.提取所得阳性重组球虫载体的基因组dna，利用引物进行pcr检测，测序，fiber2基因和荧光标签基因都成功重组，证明成功构建一种表达fiber2蛋白和荧光标签基因的重组球虫载体。
58.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
59.(1)本发明所述靶向eth_00026625基因的sgrna和eth_00026625基因编辑系统具有良好的特异性和极低的脱靶率，基因编辑效率高；将eth_00026625基因编辑系统导入柔嫩艾美耳球虫子孢子中，可以在eth_00026625基因中定点插入fiber2基因，避免了非特异性的基因编辑，编辑效率高，脱靶率低。fiber2蛋白可能刺激鸡产生中和性抗体抵抗禽4型腺病毒，同源重组质粒含有his标签，his标签分子量小，免疫原性低，方便后期蛋白检测。所述fiber2基因和荧光标签基因之间插入了间隔序列，避免了fiber2蛋白和荧光标签蛋白之间形成融合蛋白，有利于fiber2蛋白发挥免疫学活性。
60.(2)本发明通过在eth_00026625基因中定点插入fiber2基因，得到了一种可用于同时预防禽4型腺病毒和柔嫩艾美耳球虫的重组球虫载体，技术成熟，操作简单，成功率高，具有良好的重复性。构建的重组球虫载体可以通过产生子孢子的方式将编辑后的基因传递给子代球虫，实现了基因编辑的稳定性及可遗传性，降低了筛选的工作量。
61.本发明中的氨基酸和核苷酸序列如下：
62.seq id no:1：gcgctaccggctattaaggg。
63.seq id no:2：
64.mlrapkrrhsengkpeteagpspapikrakrmvrasqldlvypfdyvadpvgglnppflggsgplvdqggqltlnvtdpiiiknrsvdlahdpsldvnaqgqlavavdpegalditpdgldvkvdgvtvmvnddwelavkvdpsggldstagglgvsvddtllvdqgelgvhlnqqgpitadssgidleinpnmftvntstgsgvlelnlkaqggiqadssgvgvsvdeslqivnntlevkpdpsgpltvsanglglkydtntlavtagaltvvgggsvstpiatfvsgspslntynattvnssanafscayylqqwniqgllvtslylkldsatmgnrpgdlnsanakwftfwvsaylqqcnpsgiqagtvspstatltdfepmanrsvtspwtysangyyepsigefqvfspvvtgawnpgnigirvlpvpvsasgerytllcyslqctnasifnpnnsgtmivgpvlyscpaaslp。
65.seq id no:3：
66.aggaacaaatggagtgtgtttgaacacctcaagctcatactgagtagctcacagacccagtcgcaaaggttcgatagaggagccagcaagagagtccacaggattcattctgaatgatgccgtcaatactggaagcgttcctaataagaggacgccgaggcccctgggtccactgttgaccacgccccaccattcaaatccagtaaaaattacaagaaaaacagcaacaactagagaatgatcaactggaagttcggcatgagttcaaggacatgacgtagagctcgcaattcgta
ctgcgaaggcgtgtcaaattagtcagaagttgaatccatacaaatacctacacaactttccacaaaataactaagctcaatatgcgtagccgcccttaatagccggtagcgctctcgttaaatgctccccaaagcgctgagttcatcagggctgccatccaacgccaaaacaagctggaaacgccagcacgagataggagaggagatcccattaactcaacaggctcacatatgtatcatattaattccggccagtgtctctaaataaactcttttgtaggatctgccaactcactgcgggggggcacacagaagcaccacattgcacgacactgcttttgcgcaggctgcggggcaattaaacgttaacagtgcttgatccggccgaaatgacgcgaaatatttaaaacattatctgtttgtcagcctaacggagatgacatggtcgcacaagagactacagtgtgtgtgtgatgtctttcgtgcatcccaccgagcctctggaattcggcaccgcattagcccacacgtaaaacattgcgtacctaaccaagaagacttctcgggcagagaaaatgtaaaattatacattagcagagccacacattacactaaattgtttaattaggcttggttcacgttccgcagctcgtaatgcgggcgcgcgacagatcaacacacacacacaagcatctcggcagcacgtagtcactagtggaataaccgcgcacttcaacagaccattaaaaacctagacatttatatcctaaagcatgttctgttgaagcttcacaaagcagaattctaagacagcttagctcgtcgcaactcaggtggtgaaacagcaccatgctctagctggcagctgggactgtcacgtcgatgagccctgagtttctcatcgtacacacgcatttttcccagcatttcaattttttttgttgacccgggtgtgctcgcccactttgttcctgttgtccctttgctttctgtgtttttccgcaatggcgccccttcctcggcgaaggctagcgccctgcagggcattatcattgctggttggtctgcttgccgcaagttttgctttttctatgctccgggcccctaaaagaagacattccgaaaacgggaagcccgagaccgaagcgggaccttccccggctccaatcaagcgcgccaaacgcatggtgagagcatcccagcttgacctggtttatcctttcgattacgtggccgaccccgtcggagggctcaacccgccttttttgggaggctcaggacccctagtggaccagggcggacagcttacgctcaacgtcaccgatcccatcatcatcaagaacagatcggtggacttggcccacgaccccagtctcgatgtcaacgcccaaggtcaactggcggtggccgttgaccccgaaggggccctggacatcacccccgatggactggacgtcaaggtcgacggagtgaccgtaatggtcaacgatgactgggaactggccgtaaaagtcgacccgtccggcggattggattccaccgcgggtggactgggggtcagcgtggacgacaccttgctcgtggatcagggagaactgggcgtacacctcaaccaacaaggacccatcactgccgatagcagtggtatcgacctcgagatcaatcctaacatgttcacggtcaacacctcgaccggaagcggagtgctggaactcaacctaaaagcgcagggaggcatccaagccgacagttcgggagtgggcgtttccgtggatgaaagcctacagattgtcaacaacactctggaagtgaaaccggatcccagcggaccgcttacggtctccgccaatggcctagggctgaagtacgacactaataccctagcggtgaccgcgggcgctttaaccgtggtcggaggggggagcgtctccacacccatcgctacttttgtctcgggaagtcccagcctcaacacctacaatgccacgaccgtcaattccagcgcgaacgccttctcttgcgcctactaccttcaacagtggaacatacaggggctccttgttacctccctctacttgaaattggacagcgccaccatggggaatcgccctggggacctcaactccgccaatgccaaatggttcaccttttgggtgtccgcctatctccagcaatgcaacccctccgggattcaagcgggaacggtcagcccctccaccgccaccctcacggactttgaacccatggccaataggagcgtgaccagcccatggacgtactcggccaatggatactatgaaccatccatcggggaattccaagtgttcagcccggtggtaacaggtgcctggaacccgggaaacatagggatccgcgtcctccccgtgccggtttcggcctccggagagcgatacacccttctatgctatagtctgcagtgcacgaacgcgagcatttttaatccaaacaacagcggaaccatgatcgtgggacccgtgctctacagctgtccagcggcctccctcccgcatcatcatcatcatcatgctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacctatggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacg
gcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaaatttcgcgaagggcgtcaaacaaagtgccacagcggcctctttacttgtttgttctcactgaatttcgagatcttgagtgaagctgcacaaggaaggaaaacgtacatcctgcgccgtggtacattgcttcgctgtgcattgcgttcaataactgataaaccacaggatactttttattaggtgaatgtatcttgtgcggagtcaagcgttgagactgtacgtaccagtcgatattctttctgaagcaagagagaaacaattaaggcgctctttgtttacagtactagcagcgcctcacgcggacggtgcttcccttcatgtgaattcgtgaagaacacgtccaaaggtgactggaacattgcctaactattcaatcatgtacgatatattcatatttgcagtttatctagatgtgtttcaggtgcttaaccttttctaaccacgacaggagtcattagaattagcagcatgctttttctctagatgctatatcttgatgggtggaggagaagcagcagcgaaaggtggaggaacacatgatgagtcttgcccggagccttgctaaaacaaacgagttcgctacgtcgattgcatcatatacacctcatactaaccagtccagataatgaacattcgcaatcaaacttacaaccaaacttttgaagcattgtgcgaacaagaactaatttgcctctcgaaggatctgaatgcaagcaaacataactattccttgtgtgcgaatcgacatatgcacacagcgcagagaccgtcactttaaaccatgcttggaggaaactttgcttttccatgtctaatggcaaaaagcaagttggaataacactcctcaatatctagctacggatattctacactatcagagcccgatacgtgtgtgaaggcgagcgaagctgttcactcgtggcttcagctggaaaaataatcgacaatgcgctagacgcgggagtcgaagcgtgtctgtatgctgtcgtgagtaaacccacaggaaatcgcttaataagagctgaagaaagc。
附图说明
67.图1为实施例3中基因编辑质粒psag1-cas9-u6-sgactin3h的图谱。
68.图2为实施例3中同源重组片段的图谱。
69.图3为实施例3中第1代卵囊的荧光显微镜图片(放大倍数＝100倍)。
70.图4为实施例3中第3代卵囊的荧光显微镜图片(放大倍数＝100倍)。
71.图5为实施例4中重组球虫载体的pcr检测结果。
72.图6为测试例1中重组球虫mrna检测结果。
73.图7为测试例2中western blot的结果。
具体实施方式
74.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
75.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
76.材料：
77.pcr扩增试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；
78.质粒提取试剂盒购自赛默飞世尔科技公司；
79.q5点突变试剂盒购自neb(北京)有限公司；
80.kld点突变试剂盒购自neb(北京)有限公司；
81.柔嫩艾美耳球虫来自佛山市正典生物技术有限公司。
82.实施例1
83.本实施例提供一种靶向eth_00026625基因的sgrna，所述sgrna的核苷酸序列如seq id no:1所示。
84.seq id no:1：gcgctaccggctattaaggg。
85.本发明中，所述sgrna靶向eth_00026625基因的非编码区序列，所述sgrna具有良好的特异性与靶向性，脱靶率低，编辑效率高。
86.实施例2
87.本实施例提供一种eth_00026625基因编辑系统，所述eth_00026625基因编辑系统包括靶向eth_00026625基因的sgrna、cas9以及同源重组片段。
88.所述靶向eth_00026625基因的sgrna与所述cas9核酸酶的编码序列连接在同一个基因编辑质粒中。
89.所述同源重组片段包括eth_00026625基因5’同源臂、sag13启动子、mic1信号肽序列、fiber2基因、mcherry红色荧光蛋白、sag13终止子和eth_00026625基因3’同源臂。
90.所述eth_00026625基因编辑系统能够在柔嫩艾美耳球虫的eth_00026625基因上定点插入禽4型腺病毒的fiber2基因，避免了非特异性的基因编辑，编辑效率高，脱靶率低。
91.实施例3
92.本实施例提供一种重组球虫载体，所述重组球虫载体为经过实施例2中eth_00026625基因编辑系统编辑后，在eth_00026625基因上定点插入禽4型腺病毒的fiber2基因的柔嫩艾美耳球虫。
93.所述重组球虫载体通过如下方法进行构建：
94.(1)构建含有靶向eth_00026625基因的sgrna和cas9的基因编辑质粒：
95.选择eth_00026625基因的非编码区作为插入位点，该位点的核苷酸序列如seq id no:4所示。
96.seq id no:4：
97.tgtgggcagaaagagggcggcgtagagaggcatttagtggatgcttttgaggagttctgggaggtcatcagtagtg gggaaggtctaccgcaccgtctggtcggcctattagttaatgcccacatgaggcgatcttttggtggtgcgtgacggggtc agtcattgga。
98.利用q5点突变试剂盒进行pcr反应，正向引物序列sgmic2 f的核苷酸序列如seq id no:5所示，反向引物sgmic2 r的核苷酸序列如seq id no:6所示，模板为psag1-cas9-u6质粒，得到pcr产物，反应体系如表1所示。
99.seq id no:5：aataggccgaccagacggtggttttagagctagaaatagcaagtt。
100.seq id no:6：aacttgacatccccatttacc。
101.表1
102.试剂用量(μl)酶、dntps和缓冲液的混合物12.5正向引物1.25反向引物1.25
psag1-cas9-u6质粒1水补足至25
103.pcr反应条件如表2所示：
104.表2
[0105][0106]
pcr产物进行kld反应，kld反应的反应体系如表3所示。
[0107]
表3
[0108]
试剂用量(μl)反应缓冲液5酶混合物1pcr产物1水补足至10
[0109]
将获得的kld混合物转化dh5α感受态，提取质粒，salⅰ单酶切鉴定阳性克隆，并使用测序验证的引物m13进行单向测序，所述测序验证的引物m13的核苷酸序列如seq id no:7所示。基因编辑质粒的图谱如图1所示，所述基因编辑质粒psag1-cas9-u6-sgmic2的核苷酸序列如seq id no:3所示。
[0110]
seq id no:7：caggaaacagctatgac。
[0111]
(2)构建同源重组片段：
[0112]
依次将eth_00026625基因5’同源臂、sag13启动子、mic1部分片段、禽4型腺病毒fiber2基因、6
×
his、p2a、mcherry荧光蛋白基因、sag13终止子和eth_00026625基因3’同源臂按顺序连接得到整体片段，将所述整体片段构建到载体上，得到所述同源重组质粒，基因序列发送至深圳华大基因股份有限公司合成质粒，同源重组片段的图谱如图2所示。
[0113]
用所述同源重组质粒转化感受态细胞dh5α，提取质粒。用线性化引物pcr扩增所述同源重组质粒，所述线性化引物的正向引物的核苷酸序列如seq idno:8所示，所述线性化引物的反向引物的核苷酸序列如seq id no:9所示，获得同源重组片段，所述同源重组片段的核苷酸序列如seq id no:3所示。
[0114]
seq id no:8：aggaacaaatggagtgtgtttgaac。
[0115]
seq id no:9：gctttcttcagctcttattaagcgat。
[0116]
(3)电转染子孢子：
[0117]
将提取好的子孢子(73万个)放在4mm的电击杯中，其中加入300μl的电转液，
3000ng/μl的敲除质粒5μl，500ng/μl的同源重组质粒30μl，总体积为335μl，轻轻混匀样品后，冰浴20min。随后随时转染，转染条件为电压2000
ⅴ
、0.4ms、脉冲3次。电击后加入37℃的dmen溶液500μl，静置10min后，将样品平均接种给两只5日龄的麻鸡。
[0118]
电转液为high performance electroporation solution，美国btx公司。
[0119]
(4)筛选阳性克隆：
[0120]
收集第7到11天的粪便，纯化获得卵囊，卵囊孢子化后，在荧光显微镜下观察荧光单卵囊，图3为第1代卵囊的荧光显微镜图片，图4为第3代卵囊的荧光显微镜图片。通过上述构建方法，本实施例成功在柔嫩艾美耳球虫的eth_00026625基因上定点插入禽4型腺病毒的fiber2基因和荧光标签基因，构建了一种表达禽4型腺病毒fiber2蛋白和荧光标签的重组球虫载体。
[0121]
实施例4
[0122]
本实施例提供一种重组球虫载体检测方法，采用所述检测方法对实施例3中定点插入禽4型腺病毒的fiber2基因和荧光标签基因的重组球虫载体进行检测。检测步骤如下所示：
[0123]
fiber2全基因序列正向引物fiber2-1437f的核苷酸序列如seq id no:10所示，反向引物fiber2r-1437r的核苷酸序列如seq id no:11所示，pcr的模板包括重组球虫组、亲本株、同源从组质粒(阳性组)与阴性组，得到条带大小为1437bp的pcr产物，反应体系如表4所示。图5为重组球虫pcr结果：m表示为2000bp的marker；泳道1～4为转染成功的球虫；泳道q为亲本株对照组，泳道阳为同源重组质粒，作为阳性对照：阴为阴性对照组，使用dd水代替相应的dna模板。通过pcr电泳图与测序结果表明，fiber2基因完全插入到球虫到球虫中。
[0124]
seq id no:10：atgctccgggcccctaaaagaagac。
[0125]
seq id no:11：cgggagggaggccgctggacagctg。
[0126]
表4
[0127]
试剂用量(μl)酶、dntps和缓冲液的混合物10正向引物1反向引物1模板2水补足至20
[0128]
本发明所述的构建方法能成功构建、筛选表达禽4型腺病毒的fiber2蛋白的柔嫩艾美耳球虫，并且可通过荧光显微镜观察和pcr检测出阳性重组球虫载体。
[0129]
测试例1
[0130]
为了检验球虫是否转录出来mrna，使用500万孢子化后的球虫提取球虫rna，将提取的rna样品去除dna后，将样品进行逆转录成cdna，使用普通pcr进行检验，fiber2-mrna基因序列正向引物mrna-testf核苷酸序列如seq id no:12所示(tcccatcatcatcaagaaca)，反向引物mrna-testr核苷酸序列如seq id no:13所示(aatctgtaggctttcatcca)，cdna模板包括重组球虫、亲本株、同源重组片段、阴性对照。图6为重组球虫mrna检测结果，m表示为500bp的marker；泳道重组是转染成功的球虫；泳道亲本是亲本株球虫；泳道阳是阳性对照，使用同源从组片段作为模板；泳道阴是阴性对照组，使用dd水作为模板。通过pcr电泳图与
测序结果表明，fiber2基因可以进行转录。
[0131]
测试例2
[0132]
为了检验球虫能否翻译出fiber2蛋白，将2000万孢子化后的重组株与亲本株置于2ml离心管中，加入足量1mm玻璃珠，在破碎仪中进行破碎，条件为60hz，30s/次，共破碎3次。随后将破碎的样品置于新的离心管中，通过western blot技术检验是否存在fiber2蛋白，本实验一抗使用鼠抗his抗体，二抗使用羊抗鼠抗体，图7为本实验的结果，重组株有明显的条带产生，亲本株没有条带结果表明球虫可以产生fiber2蛋白，并能够对该蛋白进行修饰作用，形成fiber2蛋白的亚蛋白。
[0133]
实施例5
[0134]
使用spf鸡设计免疫保护实验，本实验包括重组株、亲本株、阳性组与阴性组，重组株、亲本株分别在1日龄、10日龄与20日龄免疫500、1000和5000量的球虫，阴性组与阳性组不做任何处理，通过细胞培养检测病毒毒力，稀释至最适合的攻毒浓度，在30日龄时每只鸡攻毒1ml的4型腺病毒。
[0135]
本实施例对实施例3中所述的重组球虫载体进行免疫保护效果的评估。
[0136]
免疫评估的方法如下所示：
[0137]
(1)通过死亡率来对球虫载体疫苗进行评估，存活率计算公式为存活鸡只数量
÷
总攻毒数量
×
100％。
[0138]
免疫评估的结果如表5所示。其中结果包括重组球虫、亲本株、阳性组与阴性组。
[0139]
表5
[0140]
组别存活率(％)重组球虫70～90亲本株10～40阳性组0阴性组100
[0141]
通过表5的结果可知，实施例1的重组球虫具有良好的免疫效果。
[0142]
综上，本发明所述靶向eth_00026625基因的sgrna特异性强，脱靶率低，与cas9核酸酶配合，可实现在柔嫩艾美耳球虫的eth_00026625基因上插入fiber2基因。本发明中所述eth_00026625基因编辑系统的基因编辑效率高，制备得到的重组球虫载体的基因型可稳定存在，具有良好的免疫原性，并且高效安全。
[0143]
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。