特异性结合非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体地，本发明涉及特异性结合非洲猪瘟病毒cd2v蛋白的抗体及其应用。

背景技术：

1、非洲猪瘟病毒(african swine fever virus，asfv)是一种巨大而复杂的dna病毒，是非洲猪瘟的病原体，是asfarviridae属的唯一已知的成员。非洲猪瘟是家猪中高度传染性的出血性疾病，其发病率和死亡率高达100％。asfv具有多个天然宿主和贮存库，这进一步加大了非洲猪瘟的潜在威胁性。鉴于这种跨界动物疾病的巨大风险和威胁，非洲猪瘟已被列入世界动物卫生组织(oie)陆生动物卫生法典。asfv拥有170-194kb的大型线性双链dna(dsdna)基因组，编码150多种蛋白质。尽管已经从病毒体中鉴定出多达68种结构蛋白，但大多数蛋白的功能尚不清楚。asfv病毒体具有独特的多层结构，细胞内病毒体由核苷(第一层)，内核壳(第二层)，内膜(第三层)和衣壳(第四层)构成。细胞外病毒体具有额外的外部包膜(第五层)。细胞内和细胞外asfv病毒体都具有传染性。构成病毒颗粒的结构蛋白分布在这些多层结构中，并在病毒感染中发挥各种作用。

2、目前，asfv具有25个基因型，抗原性结构蛋白的多样性也可能会对asfv感染的可靠诊断产生巨大影响。为了深入研究抗原性结构蛋白在病毒感染中发挥的作用，并实现对asfv病毒感染的准确诊断，本领域仍需要更多能够识别asfv不同结构蛋白、不同抗原表位的单克隆抗体，为防治非洲猪瘟提供新方向和新思路。cd2v蛋白由asfv的ep402r基因编码，为asfv晚期表达跨膜蛋白，具有n端信号肽和单个跨膜结构域，是一种重要的病毒糖基化蛋白。cd2v有三种表达形式，分别是89kda的全长糖基化蛋白，及通过蛋白水解作用产生的大小为63kda的n-末端糖基化片段和大小约为26kda的c-末端非糖基化片段，在受感染的动物细胞中能引起红细胞吸附现象，在病毒的传播和复制过程发挥着重要作用。因此，asfvcd2v蛋白是一个良好的靶点，用于asfv的检测和治疗药物的研发均具有良好的应用前景。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种特异性结合非洲猪瘟病毒cd2v蛋白的抗体，以解决上述现有技术中存在的技术问题，该抗体能够特异性的识别并结合cd2v蛋白，这为进一步研究cd2v蛋白的生物学功能提供了有价值的工具。

2、为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

3、抗体或其抗原结合片段

4、在一个方面，本发明提供了一种特异性结合非洲猪瘟病毒cd2v蛋白的抗体或其抗原结合片段。

5、进一步，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区；

6、所述重链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:2、seq idno:3、seq id no:4所示；

7、所述轻链可变区的cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:10、seq idno:11、seq id no:12所示。

8、进一步，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别如seq id no:9、seq id no:17所示。

9、在某些实施方案中，本发明所述的抗体或其抗原结合片段还包括与上述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列所对应的抗体或其抗原结合片段，也即在对应的氨基酸序列或核苷酸序列的基础上将任意一个或多个位置的氨基酸或核苷酸替换为其他任意氨基酸或核苷酸之后得到的氨基酸序列或核苷酸序列所对应的抗体或其抗原结合片段，只要与本发明上述的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列所对应的抗体或其抗原结合片段均在本发明的保护范围内。

10、在某些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段还包括上述氨基酸序列所对应的抗体或其抗原结合片段的功能性变异体，具体地，所述功能性变异体包括但不限于：在一级结构序列中基本类似、但包括本发明的亲本单克隆抗体中没有的，例如体外或体内的化学和/或生物化学改性的衍生物。这些改性包括例如乙酰化、酰化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、交联、二硫键的形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解处理、磷酸化，这样的功能性变异体同样包含在本发明的保护范围内。

11、核酸分子

12、在另一方面，本发明提供了一种编码本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的核酸分子。

13、在一些实施方案中，所述核酸分子是分离的或纯化的，一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列。

14、在一些实施方案中，本发明所述的核酸分子可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(pcr)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。在某些实施方案中，所述分离的核酸是通过重组dna技术制备的核酸分子。在本技术中，可以通过本领域已知的多种方法来制备编码本发明第一方面所述抗体或其抗原结合片段的核酸，这些方法包括但不限于：采用限制性片段操作或采用合成性寡核苷酸的重叠延伸pcr。

15、重组表达载体

16、在另一方面，本发明提供了一种包含本发明第二方面所述的核酸分子的重组表达载体。

17、在一些实施方案中，所述重组表达载体中的核酸分子与启动子可操作性地连接，所述启动子包括但不限于：cmv启动子、amp启动子、reca启动子、sp6启动子、trp启动子、tac启动子、lac启动子、lacuv5启动子、lpp启动子、plλ启动子、prλ启动子、rac5启动子、t7启动子、sv40启动子、mmtv启动子；所述载体包括但不限于质粒载体、粘粒载体、病毒载体，其中，所述病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、噬菌体载体。

18、在一些实施方案中，所述病毒载体还包括疱疹病毒(例如，单纯性疱疹病毒(hsv))、基于sv40的运载体、乳头状瘤病毒、hbp epstein barr病毒、牛痘病毒、sinbis病毒、流感病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒(ndv)、麻疹病毒、水疱性口炎病毒(vsv)、细小病毒、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、塞内卡谷病毒(seneca valley virus)、柯萨奇病毒、肠病毒、粘液瘤病毒、马拉巴病毒(marabavirus)、或塞姆利基森林病毒(sfv)。

19、在一些实施方案中，当使用原核细胞作为宿主细胞时，所述表达载体通常包括能够传播转录的强启动子(例如，tac启动子、lac启动子、lacuv5启动子、lpp启动子、plλ启动子、prλ启动子、rac5启动子、amp启动子、reca启动子、sp6启动子、trp启动子或t7启动子)、用于启动翻译的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。

20、在一些实施方案中，当使用真核细胞作为宿主细胞时，可以使用源自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子或人肌肉肌酸启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5k启动子、sv40启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、hsv的tk启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、hiv的ltr启动子、莫洛尼病毒的启动子、eb病毒(ebv)的启动子或劳斯肉瘤病毒(rsv)的启动子)，并且通常具有聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。

21、在一些实施方案中，所述载体可以与另一序列融合以促进由其表达的抗体的纯化。融合的序列的例子包括但不限于：谷胱甘肽s-转移酶、麦芽糖结合蛋白、flag和6x his。所述载体还可以含有作为选择标记物的本领域常用的抗生素抗性基因，例如赋予对氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素或四环素的抗性的基因。

22、宿主细胞

23、在另一方面，本发明提供了一种包含本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的重组表达载体的宿主细胞。

24、在一些实施方案中，所述宿主细胞包括原核细胞和真核细胞，其中，所述原核细胞包括细菌(例如，大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌、葡萄球菌)、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞。

25、在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞包括cho细胞、cos细胞、nso细胞、hela细胞、bhk细胞，hek293细胞等动物细胞，在本发明的具体实施方案中，所述宿主细胞优选为hek293细胞；如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

26、用于检测非洲猪瘟病毒的试剂

27、在另一方面，本发明提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒的试剂。

28、进一步，所述试剂包含本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；

29、优选地，所述抗体或其抗原结合片段是被可用于检测的标记物标记的抗体或其抗原结合片段；

30、更优选地，所述可用于检测的标记物包括荧光色素、亲和素、顺磁性离子、放射性同位素；

31、最优选地，所述荧光色素包括荧光素、罗丹明、texas红、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、多甲藻黄素-叶绿素蛋白；

32、最优选地，所述亲和素包括生物素、卵白亲和素、链亲和素、卵黄亲和素、类亲和素；

33、最优选地，所述顺磁性离子包括铬(iii)、锰(ii)、铁(iii)、铁(ii)、钴(ii)、镍(ii)、铜(ii)、钕(iii)、钐(iii)、镱(iii)、钆(iii)、钒(ii)、铽(iii)、镝(iii)；

34、最优选地，所述放射性同位素包括放射性碘、放射性铯、放射性铱、放射性钴。

35、用于检测非洲猪瘟病毒的试剂盒

36、在另一方面，本发明提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒的试剂盒。

37、进一步，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。

38、在一些实施方案中，所述试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等，在另一些实施方案中，所述试剂盒还包含用于溶解待测样品的裂解介质、检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。

39、药物组合物

40、在另一方面，本发明提供了一种药物组合物。

41、进一步，所述药物组合物包含治疗有效量的本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。

42、在一些实施方案中，所述药物组合物还可包含一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂，所述“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域所公知的(参见例如remington'spharmaceutical sciences.edited by gennaro ar,19thed.penns ylvania:mackpublishing company,1995)，并且包括但不限于：ph调节剂、表面活性剂、佐剂、离子强度增强剂、稀释剂、维持渗透压的试剂、延迟吸收的试剂、防腐剂。例如，ph调节剂包括但不限于：磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于：阳离子、阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween-80。离子强度增强剂包括但不限于：氯化钠。防腐剂包括但不限于：各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。维持渗透压的试剂包括但不限于：糖、nacl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于：单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于：水、水性缓冲液(如缓冲盐水)、醇和多元醇(如甘油)等。防腐剂包括但不限于：各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞、2-苯氧乙醇、对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等。稳定剂具有本领域技术人员通常理解的含义，其能够稳定药物中的活性成分的期望活性，包括但不限于：谷氨酸钠、明胶、spga、糖类(如山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，乳糖，葡聚糖，或葡萄糖)、氨基酸(如谷氨酸，甘氨酸)、蛋白质(如干燥乳清，白蛋白或酪蛋白)或其降解产物(如乳白蛋白水解物)等。

43、生产方法、检测方法和制备方法

44、在另一方面，本发明提供了如下任一种方法：

45、(1)一种生产如本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括如下步骤：培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从所述培养的体系中分离纯化得到抗体或其抗原结合片段，即为本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；

46、(2)一种体外非诊断目的地检测待测样品中非洲猪瘟病毒cd2v蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段与待测样品接触，检测所述抗体或其抗原结合片段与所述待测样品中cd2v蛋白的复合物的形成；

47、在一些实施方案中，所述抗体或其抗原结合片段是被可用于检测的标记物标记的抗体或其抗原结合片段，所述可用于检测的标记物包括荧光色素、亲和素、顺磁性离子、放射性同位素。

48、(3)一种制备本发明第四方面所述的宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的重组表达载体引入到宿主细胞中，得到本发明第四方面所述的宿主细胞。

49、在一些实施方案中，所述引入的方法包括物理方法、化学方法、生物方法，其中，所述物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔；所述化学方法包括胶体分散系统(大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠)、基于脂质的系统(水包油乳剂、胶束、混合胶束、脂质体)；所述生物方法包括dna载体、rna载体、慢病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。

50、本发明还提供了一种诊断受试者是否感染非洲猪瘟病毒的方法，所述方法包括如下步骤：使用本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段检测非洲猪瘟病毒在来自所述受试者的待测样品中是否存在。

51、在一些实施方案中，所述受试者优选为猪，包括各种类型的家猪和野猪，所述待测样品可选自：来源于受试者的尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、非组织缔合的细胞、组织、组织学制备物。

52、本发明还提供了一种用于治疗非洲猪瘟病毒感染性疾病的方法，所述方法包括如下步骤：给有需要的受试者施用有效量的本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、和/或本发明第七方面所述的药物组合物，其中，所述受试者优选为猪，包括各种类型的家猪和野猪。

53、应用

54、在另一方面，本发明提供了如下任一方面应用：

55、(1)本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的重组表达载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、本发明第五方面所述的试剂在制备用于检测或辅助检测非洲猪瘟病毒的产品中的应用；

56、(2)本发明第一方面所述抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的重组表达载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、本发明第五方面所述的试剂在制备用于诊断或辅助诊断非洲猪瘟病毒感染性疾病的产品中的应用；

57、(3)本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的重组表达载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、本发明第五方面所述的试剂在制备检测非洲猪瘟病毒cd2v蛋白的产品中的应用；

58、(4)本发明第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的重组表达载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、本发明第七方面所述的药物组合物在制备用于治疗非洲猪瘟病毒感染性疾病的药物中的应用。

59、相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：

60、本发明提供了一种能够特异性识别并结合非洲猪瘟病毒cd2v蛋白的单克隆抗体，且所述单克隆抗体目前尚未见报道，本发明还提供了包含所述单克隆抗体的核酸分子、重组表达载体、宿主细胞、检测试剂、试剂盒、药物组合物等衍生产品，对非洲猪瘟病毒的检测、诊断和治疗具有重要意义。