一种用于血液恶性肿瘤临床诊疗中的组合物及其应用的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及一种用于血液恶性肿瘤临床诊疗中的组合物，其适用于大部分血液恶性肿瘤微小残留病灶(mrd)追踪检测以及患者免疫动态监测的技术。

背景技术：

1、血液恶性肿瘤是最为常见的致命性肿瘤之一，大部分血液肿瘤，如急性淋巴细胞白血病在儿童中的发病率尤其突出，是导致儿童死亡的主要因素之一。研究表明，我国淋巴瘤患者目前以b细胞淋巴瘤为主，其临床诊断主要依赖组织形态学，具有一定的局限性，有时常规的病理检查很难鉴别出一些淋巴瘤、淋巴组织的良性增生和不典型增生，因此，有必要寻找更准确的检测方法和特异性指标来协助诊断。

2、功能性t细胞或者b细胞表面的抗原特异性受体tcr或bcr在任意指定时间的多样性总和被称为免疫组库(ir)，而随着细胞遗传学以及分子生物学的飞速发展，bcr或tcr的v(d)j基因重排的检测越来越多的被应用到临床上，如疫苗研发以及临床辅助诊断等等。血液系统肿瘤患者的免疫组库状态与健康人相比具有病理性变化，可能存在高频的亚克隆作为肿瘤性标志物，患者表现出免疫组库克隆型的高克隆性与低多样性。同时，此前的研究表明几乎所有类型的肿瘤都具有较高的异质性，部分肿瘤在起源和发展阶段展现出差异性的克隆异质性。因此，鉴定血液恶性肿瘤中免疫组库的克隆型可以划分特定肿瘤的亚型，而监测微小残留病灶(mrd)则可能有助于评估疾病的阶段性治疗效果以及制定相应的治疗策略。同时，血液恶性肿瘤中经常发生克隆演化，目前被认为与患者的临床预后可能存在关联。对血液恶性肿瘤患者ir中的主要克隆进行监测，探查其是否发生克隆的转换和演化，对患者的临床治疗方案的制订具有指导意义。

3、以往，对免疫组库多样性研究主要是通过多参数流式细胞术(fcm)、cdr3谱性分析以及pcr结合sanger第一代测序来进行。多参数流式细胞术可根据肿瘤细胞免疫表型特点将其与正常细胞鉴别，操作简单快速，同时多参数流式细胞术也可以以多种肿瘤样本作为检测目标，包括循环肿瘤细胞等。但流式细胞术检测灵敏度较低，仅有10-3-10-4，多参数流式细胞术虽然可以在蛋白水平对个体免疫组库中不同克隆的群体和表达情况进行分类分析，但无法获得不同克隆亚家族的详细信息，不适合对精确的恶性克隆序列进行mrd的追踪监测。cdr3谱性分析可以定量比较单个亚家族克隆的频率变化，但仅能检测cdr3长度的多态性，无法分析cdr3的具体序列。pcr结合sanger测序方法允许对cdr3长度及序列进行详细分析，然而受限于测序的通量和效率，sanger测序法难以全面解析个体的免疫组库信息。

4、虽然，现阶段的医学技术在血液肿瘤的治疗上取得了巨大进步，患者在经过化疗、靶向治疗以及造血干细胞移植等治疗之后，癌症得到了缓解，但仍不能保证患者的无进展生存期，多数患者将面临复发风险。近年来有大量研究表明，血液肿瘤的复发与肿瘤的mrd密切相关，mrd的出现时间越早，检测数值越高，病人的复发越快，其三年总生存率越低。同时，过往的研究表明，tcr免疫组库的多样性与克隆性已经开始被作为一种评估患者预后与复发风险的指标进行研究，提示tcr的多样性与克隆性具有作为恶性肿瘤分子标志物的应用潜力。

5、在目前的血液肿瘤诊疗中，mrd不仅被作为一项非常重要的预后判断指标，用以评估患者的用药效果和复发几率；同时也将影响病患后续治疗方案的决策。因此，监测治疗后病患mrd水平，并且通过ngs结合的免疫组库技术对患者mrd中特异性克隆进行追踪，反复检测原始克隆的表达水平，同时监测新生恶性克隆的发生，提前预判患者身体机能的变化，有助于为每位患者量身制定精准的医疗策略，达到最理想的治疗效果。而对患者机体免疫动态的直接观察可以辅助临床前瞻性地评估患者预后，辅助改善患者临床治疗方案，使患者生存获益。

6、mrd的检测面临的挑战是巨大的。采取普通手段如形态学检测或者免疫组化等技术难以真实反映患者机体微量肿瘤细胞，易出现假阴性；而通过化学染色判断目标细胞是淋系还是髓系则依赖于检测医生的专业与经验，具有太强的主观性。通过pcr技术检测v(d)j基因的重排与否来判断患者mrd的情况虽然具有更统一的识别标准，但是仍然受到极大的限制，例如价格昂贵、操作复杂以及灵敏度不高等，同时也无法有效获取具体克隆型以用于长时间的追踪，进行精准的预后评估。因此一个广泛适用于临床的、具有高灵敏性和规范化的适配于mrd检测的产品具有相当的应用价值和前景。目前国内针对mrd检测的免疫组库相关产品已经进入初步研发阶段，但无论是从市场层面还是技术层面来看，目前的产品仍无法完全临床满足病人的数量以及科研工作者的需求。同样的，在临床检验中直观的反应患者整体免疫状态的技术目前仍然缺乏，免疫组库结合ngs技术的出现与应用为临床治疗以及相关研究都提供了巨大的机会。

技术实现思路

1、基于上述表述，本发明通过数据库获取tcr与bcr重排的特异性引物片段进行配对设计，建立了一个适用于人类免疫组库多重pcr的引物集，可对cdr3序列和不完全重排序列进行多重扩增，该多种检测指标引物，囊括igh、igdh、igk、igl、trb-vj、trb-dj、trg、trd，进一步通过研究表明，该引物集能够在多种血液恶性肿瘤中进行临床多指标检测，并能够显著提高临床样本的阳性检出，可以全面的对患者个体免疫组库进行检测，获得所有异常克隆，精确的反应机体免疫状态。

2、本发明的目的之一在于保护一种用于血液恶性肿瘤临床诊疗中的组合物，即上述的引物集，至少包括分别扩增igh、igdh、igk、igl、trb-vj、trb-dj、trg、trd的引物集。

3、在使用时，为了便于反应pcr扩增反应的成败以及计算pcr扩增倍数，进一步引入了具有明确拷贝数的包含了多条序列的内参集作为质量控制环节，该内参集的结构主要模拟了天然的v(d)j基因组合，结合该内参集，本发明可以校正引物偏好性、计算实际扩增倍数以及定量细胞数。

4、进一步，本发明还可以引入在所有物种中相对保守的持家基因-actin作为内参，该基因作为细胞骨架蛋白编码的基因、稳定表达，通过引入actin，本发明可以对有核细胞数以及异常细胞数进行更精确的定量，适用于mrd的追踪监测。

5、其中，上述组合物中，扩增igh的引物中，上游引物序列如seq idno:1～22所示，下游引物序列如seq id no:23～25所示；和/或

6、扩增igdh的引物中，上游引物序列如seq id no:26～33所示，下游引物序列如seqid no:34所示；和/或

7、扩增igk的引物中，上游引物序列如seq id no:35～46所示，下游引物序列如seqid no:47～51所示；和/或

8、扩增igl的引物中，上游引物序列如seq id no:52～57所示，下游引物序列如seqid no:58所示；和/或

9、扩增trb-vj的引物中，上游引物序列如seq id no:59～96所示，下游引物序列如seq id no:97～110所示；和/或

10、扩增trb-dj的引物中，上游引物序列如seq id no:111～112所示，下游引物序列如seq id no:97～110所示；和/或

11、扩增trd的引物中，上游引物序列如seq id no:113～121所示，下游引物序列如seq id no:122～127所示；和/或

12、扩增trg的引物中，上游引物序列如seq id no:128～135所示，下游引物序列如seq id no:136～139所示；和/或

13、人工内参集的序列如seq id no:140～294所示。

14、进一步，持家基因actin引物序列如seq id no:295～296所示。

15、进一步，该组合物还包括测序引物和标签，其中上游测序引物和标签的序列如seqid no:297～304所示，下游测序引物和标签的序列如seq idno:305～316所示。

16、本发明的目的之二在于保护一种用于血液恶性肿瘤临床诊疗中的试剂盒，包括上述的组合物。

17、具体地，该试剂盒包括试剂a和试剂b，所述试剂a至少包括分别扩增igh、igdh、igk、igl、trb-vj、trb-dj、trg、trd的引物集和模拟天然vj和dj序列的人工内参集；所述试剂b包括测序引物和标签集。

18、进一步，所述试剂a还包括持家基因actin序列。

19、本发明的目的之三在于保护上述组合物或者试剂盒在对血液恶性肿瘤患者免疫组库描述和/或mrd追踪检测和/或免疫动态监测中的应用，且上述应用均以非疾病的诊断和治疗为目的，如为了科学研究、实验等的研究中。

20、具体地，至少包括以下步骤：获得待测样本中有核细胞的基因组dna或cdna或cfdna，加入上述具有明确拷贝数的人工内参集，采用上述的扩增引物集进行多重pcr扩增，对多重pcr扩增产物进行二次扩增以添加测序接头，构建文库，上机测序并将测序得到的免疫组库文件，进行质控和预处理以及拼接，将拼接好的序列与imgt数据库比对，依据cdr3序列进行克隆聚类，生成按照克隆丰度排序的文件，计算mrd，mrd＝(rt*cir/rir)/tnk，其中，rt是测序所得肿瘤的reads数，rir是测序所得内参照集的reads数，cir是添加的每组内参集的拷贝数，由数字pcr定量所得，tnk＝mk/a，tnk是有核细胞的总数量，mk是有核细胞的dna总量，可视为实验中dna的投入量，a为单个细胞中dna总量平均值，即0.0064ng；或

21、获得待测样本中有核细胞的基因组dna或cdna或cfdna，加入上述具有明确拷贝数的人工内参集和上述的持家基因actin序列，采用上述的扩增引物集进行多重pcr扩增，对多重pcr扩增产物进行二次扩增以添加测序接头，构建文库，上机测序并将测序得到的免疫组库文件，进行质控和预处理以及拼接，将拼接好的序列与imgt数据库比对，依据cdr3序列进行克隆聚类，生成按照克隆丰度排序的文件，计算mrd，mrd＝(rt*cir/rir)/(rt*ch/rh)，其中rt为临床模板中扩增所得持家基因的reads，rh是添加的带有特殊标记的内参中测序所得持家基因质粒的reads数，ch是持家基因质粒内参中的原始拷贝数。

22、进一步，多重pcr中扩增igh的引物的终浓度为0.29μm，扩增igdh的引物的终浓度为0.2μm，扩增igk的引物的终浓度为0.11μm，以及扩增igk的引物的终浓度为0.09μm；同时，多重pcr中扩增trb-vj的引物的终浓度为0.5μm，扩增trb-dj的引物的终浓度为1.45μm，扩增trd的引物的终浓度为2μm，以及扩增trg的引物的终浓度为1.33μm。通过调整合适的引物浓度，经过多次测试，解决了多重pcr扩增的引物偏好性问题。

23、利用本发明所提供的组合物可以对各类血液恶性肿瘤在基因层面进行检测判断，检测患者的肿瘤细胞克隆，计算比例，标记追踪相关克隆，对疾病进程进行精确监测；同时还可以通过检测患者的tcr免疫组数据，获取患者的免疫状态，对患者的预后进行评估；通过长期实时追踪患者mrd，还能够及时发现新恶化的肿瘤相关克隆指示疾病进程，同时还能实现对患者机体免疫动态的探查。其主要包括文库构建和ngs生物信息技术分析，文库构建主要包含了igh、igdh、igk、igl、trb-vj、trb-dj、trg、trd，囊括了bcr和tcr的完全重排与非完全重排，同时，还包含了覆盖免疫组库cdr3的引物集、模拟天然v(d)j序列的人工序列-内参序列集以及持家基因内参序列，采用illumina所述index相关引物第二轮扩增，以添加测序接头，完成文库构建，同时测序中的通量限制和效率的问题得到了解决。结合ngs对免疫组库进行分析，既可以从不同的遗传物质如dna、rna以及cfdna等起始反应发生，获得全方面的免疫组库信息，又允许在个体中精确的监测不同时间段的免疫组库中克隆型的频率和多样性的实时状态，为个体的疾病诊断与药物治疗评估提供可靠的信息。该方法针对的可以是样本中的dna、rna，也可以是cfdna，当其采用rna进行检测时，先将rna反转录即可。

24、另外，还可以从tcr免疫组库中获取克隆多样性、克隆性以及氨基酸多态性等数据进行分析，监测患者临床免疫动态，多方面评估患者治疗预后，其中主要囊括d50、shannon指数、基尼系数以及pielou’s系数等指标。其中d50＝reads首次达到50％的序列种类/序列总数，shannon’s entropy index＝h′＝-σp i lnp i；gini-simpson diversity index＝d＝1-σp i2；pielou’s index＝e＝h/hmax。