一种耐碱芽殖球菌及其菌剂与应用的制作方法

sp.nov.,an actinomycete from beach sediment,and emended description of the genus blastococcus ahrens and moll 1970.int j syst evol microbiol 2006；56:2391
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2396；xi l,ruan j,huang y.diversity and biosynthetic potential of culturable actinomycetes associated with marine sponges in the china seas.int j mol sci 2012；13:5917
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5932；lee dw,lee h,kwon bo,khim js,yim uh,kim bs,kim jj.blastococcus litoris sp.nov.,isolated from sea-tidal flat sediment.int j syst evol microbiol 2018；68:3435-3440)，也有分离自植物内生生境(zhu wy,zhang jl,qin yl,xiong zj,zhang df et al.blastococcus endophyticus sp.nov.,an actinobacterium isolated from camptotheca acuminata.int j syst evol microbiol 2013；63:3269
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3273.)、沙漠土(yang zw,asem md,li x,li ly,salam n,alkhalifah dhm,hozzein wn,nie gx,li wj.blastococcus deserti sp.nov.,isolated from a desert sample.arch microbiol 2019；201:193-198.)，绝大部分的成员则分离自墓碑及石头表面(urz
ì
c,salamone p,schumann p,rohde m,stackebrandt e.blastococcus saxobsidens sp.nov.,and emended descriptions of the genus blastococcus ahrens and moll 1970and blastococcus aggregatus ahrens and moll 1970.int j syst evol microbiol 2004，54:253
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259；hezbri k,louati m,nouioui i,gtari m,rohde m et al.blastococcus capsensis sp.nov.,isolated from an archaeological roman pool and emended description of the genus blastococcus,b.aggregatus,b.saxobsidens,b.jejuensis and b.endophyticus.int j syst evol microbiol 2016；66:4864
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4872；hezbri k,nouioui i,rohde m,schumann p,gtari m et al.blastococcus colisei sp.nov,isolated from an archaeological amphitheatre.antonie van leeuwenhoek 2017；110:339
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346；urz
ì
c,brusetti l,salamone p,sorlini c,stackebrandt e et al.biodiversity of geodermatophilaceae isolated from altered stones and monuments in the mediterranean basin.environ microbiol 2001；3:471
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479；gtari m,essoussi i,maaoui r,sghaier h,boujmil r et al.contrasted resistance of stone-dwelling geodermatophilaceae species to stresses known to give rise to reactive oxygen species.fems microbiol ecol 2012；80:566
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577；hezbri k,nouioui i,rohde m,sproer c,schumann p,gtari m,klenk hp,montero-calasanz mdc,ghodhbane-gtari f.blastococcus xanthinilyticus sp.nov.,isolated from monument.int j syst evol microbiol 2018；68:1177-118；louati m,hezbri k,montero-calasanz mdc,rohde m,goker m,ghodhbane-gtari f,klenk hp,nouioui i,gtari m.blastococcus tunisiensis sp.nov.,isolated from limestone collected in tunisia.int j syst evol microbiol 2022；72:5441.)。
4.芽殖球菌属多数成员分离自营养贫瘠、生存条件严苛的石头表面，因此这类菌常被认为是研究生命对环境压力的适应机制的绝佳材料(sghaier h,hezbri k,ghodhbane-gtari f,pujic p,sen a et al.stone-dwelling actinobacteria blastococcus saxobsidens,modestobacter marinus and geodermatophilus obscurus proteogenomes.isme j 2016；10:21
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29.)。
alkalitolerans)h2206、前文第二方面中所述的培养物和/或前文第三方面中所述的代谢物。
20.所述菌剂为生产木聚糖酶的菌剂。
21.上述菌剂中，所述菌剂除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。
22.上述菌剂中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
23.根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、ph调节剂等。
24.第五方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的耐碱芽殖球菌(blastococcus alkalitolerans)h2206或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂在如下任一中的应用：
25.(a1)生产木聚糖酶；
26.(a2)制备用于生产木聚糖酶的产品；
27.(a3)制备具有木聚糖酶活性的产品。
28.进一步地，所述应用为正常条件或胁迫条件下的应用；所述胁迫为盐胁迫和/或碱胁迫。
29.其中，所述盐胁迫为8％(8g/100m l)nacl以下条件，所述碱胁迫为ph 7.0-9.0条件。
30.第六方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的耐碱芽殖球菌(blastococcus alkalitolerans)h2206或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂在如下任一中的应用：
31.(b1)食品加工；
32.(b2)制备饲料添加剂；
33.(b3)土壤调理；
34.(b4)有机废物降解；
35.(b5)有机肥料添加剂；
36.(b6)水产养殖。
37.木聚糖是以木吡喃糖为单位的由β-1，4键连接的半纤维素，在自然界中含量占生物量的30％。木聚糖酶是一类木聚糖降解酶系，属于水解酶类，包括内切一β-1,4一木聚糖酶、外切β-木聚糖酶和β-木二糖苷酶。木聚糖酶能够高效率降解食品、饲料、有机肥、农副产品、土壤等自然环境中的纤维素、半纤维素等物质，提高生物质的转化效率。因此，前文第一方面中所述的耐碱芽殖球菌(blastococcus alkalitolerans)h2206或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂可以应用于上述(b1)-(b6)。
38.进一步地，所述应用为正常条件或胁迫条件下的应用；所述胁迫为盐胁迫和/或碱胁迫。
39.其中，所述盐胁迫为8％(8g/100m l)nacl以下条件，所述碱胁迫为ph 7.0-9.0条件。
40.第七方面，本发明要求保护一种用于生产木聚糖酶的产品。
41.本发明要求保护的用于生产木聚糖酶的产品，其活性成分为前文第一方面中所述的耐碱芽殖球菌(blastococcus alkalitolerans)h2206或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂。
42.第八方面，本发明要求保护一种具有木聚糖酶活性的产品。
43.本发明所要求保护的具有木聚糖酶活性的产品，其活性成分为前文第一方面中所述的耐碱芽殖球菌(blastococcus alkalitolerans)h2206或前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂。
44.第九方面，本发明要求保护一种生产木聚糖酶的方法。
45.本发明要求保护的生产木聚糖酶的方法，可包括如下步骤：对前文第一方面中所述的耐碱芽殖球菌(blastococcus alkalitolerans)h2206进行发酵培养，从培养产物中获得木聚糖酶。
46.第十方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的耐碱芽殖球菌(blastococcus alkalitolerans)h2206在制备前文第二方面中所述的培养物或前文第三方面中所述的代谢物或前文第四方面中所述的菌剂中的应用。
47.实验证明，本发明菌株h2206是一株产木聚糖酶的芽殖球菌新物种，将其命名为耐碱芽殖球菌(blastococcus alkalitolerans)。以该菌株为主成分制备的微生物菌剂，可用于食品加工，饲料添加剂，土壤调理，有机废物降解，有机肥料添加剂水产养殖等方面。
48.保藏说明
49.分类命名：耐碱芽殖球菌(blastococcus alkalitolerans)；
50.参椐的生物材料：h2206；
51.保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
52.保藏机构简称：cgmcc；
53.地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
54.保藏日期：2022年12月7日；
55.保藏中心登记入册编号：cgmcc no.26165。
附图说明
56.图1为菌株h2206的形态学观察结果图片。a是透射电镜下观察到的菌株h2206细胞形态；b是菌株h2206在pyg培养基上28℃培养72h的菌落形态照片。
57.图2为菌株h2206细胞极性脂组分分析结果图。
58.图3为基于菌株h2206和相关菌株的16s rrna基因序列构建系统发育树。系统发育树以acidothermus cellulolyticus dsm 8971t(aj007290)为外群。
具体实施方式
59.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
60.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
61.实施例1、菌株h2206的分离筛选及鉴定
62.一、菌株h2206的分离
63.菌种分离培养基：木聚糖2g/l，酵母浸粉5g/l，caco
3 2g/l，k2hpo
4 1g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，琼脂粉20g/l，ph7.2。添加氨曲南(50μg/l)、重铬酸钾(50μg/l)为抑制剂。
64.用于菌种分离的土壤样品采集自青海省海南藏族自治州贵德县拉脊山植物根际土。新鲜土壤样品室温风干2周后，120℃干热15min。取干热后的土壤2g，加入到18ml无菌生理盐水，置于28℃摇床中40min，转速为200r/min，使土壤颗粒充分悬浮，梯度稀释制备10-4
稀释度的土样悬液。
65.菌种分离与纯化：取0.2ml涂布于分离培养基平板，28℃，倒置培养4周。4周后，根据菌落特征(形状、颜色、大小、表面光泽等)挑取不同的单菌落至pyg培养基平板上(培养基成分：蛋白胨3g/l，酵母浸膏粉5g/l，甘油10g/l，甜菜碱1.25g/l，丙酮酸钠1.25g/l，琼脂15g/l，ph 7.5)，四分划线法纯化培养物。获得的纯菌株以20％(v/v)甘油作为保护剂，进行液氮保藏和-80℃冷冻保藏。
66.本次实验中，分离纯化得到菌株h2206。
67.二、木聚糖酶产生菌的筛选及菌株h2206产木聚糖酶活性测定
68.木聚糖酶在造纸工业上对纸浆生物漂白、酿酒工业、饲料与食品加工工业等行业已经得到了广泛的应用(collins t,gerday c,feller g.xylanases,xylanase families and extremophilic xylanases.fems microbiol rev,2005,29:3-23；begq k,kapoor m,ahajan i,et al.microbial xylanases and their industrial applications:a review.appl microbiol biotechnol,2001,56:326-338；方洛云，邹晓庭.木聚糖酶基因的分子生物学与基因工程.中国饲料(chinese feed),2002,7:11-13.)。木聚糖酶在当前最被看好的应用前景是在生产燃料方面。在纤维素酶和木聚糖酶的协同作用可以将植物纤维彻底水解为单糖，再运用基因工程和发酵工程生产酒精，是现在燃料酒精研究开发的热点和最为推崇的一种生产工艺。
69.木聚糖酶产生菌的筛选及木聚糖酶活性测定方法：
70.(1)木聚糖酶产生菌筛选培养基：木聚糖10g/l，mgso
4 1g/l，k2hpo
4 3g/l，(nh4)2so
4 5g/l，cacl
2 0.1g/l，feso
4 0.04g/l，znso
4 0.03g/l，kcl 0.02g/l，cuso
4 0.001g/l，mnso
4 0.0001g/l。ph7.0。
71.(2)初筛：菌株接种到筛选培养基中，28℃恒温摇床200r/min转速培养72h。发酵液1500g离心10min，保留上清液，即为粗酶液。取0.5ml上述粗酶液，加入0.5ml的0.1mol/l mops-naoh缓冲液调节ph为7.0。振荡混匀后50℃下与0.5ml azo-wheat arabinoxylan底物混合均匀，孵育10分钟。10分钟后体系中加入2.5ml的95％乙醇终止反应，用vortex剧烈振
荡混匀。室温静置10分钟。1500g离心10分钟，测定上清od
590 nm
处吸光值，参照标准曲线计算酶浓度。在上述测定条件下，每分钟释放1μmol还原糖(以木糖计)所需酶量定义为一个酶活力单位(iu/ml)，将酶活力单位高于10的菌株界定为初筛阳性菌株。
72.(3)酶活性条件优化：对初筛阳性菌株参照文献(陈红歌，朱静，梁改芹，严自正，张树政.酸性木聚糖酶产生菌的筛选及产酶条件.微生物学报(acta microbiologica sinica),1999,39,350-353；乐易林，熊涛，曾哲灵，程池.紫外诱变里氏木霉rut c-30提高木聚糖酶.食品与发酵工业.(food and fermentation insustries),2005,74-76；胡源媛，张守文，谢应根.紫外诱变芽孢杆菌选育木聚糖酶高产菌株.中国食品添加剂(china food additives)2006,113-117)的方法进行产酶条件和酶活性优化优化，包括菌种发酵培养基的优化、发酵温度和时间、酶反应条件(温度、ph值、反应时间)优化。
73.(4)复筛：初筛得到的阳性菌株再进行复筛，将筛选菌株接种到筛选培养基中，28℃200r/min培养72h。取发酵液1500g离心10分钟后测定酶活。重复三次测定取平均值，即为菌株的酶活力。
74.结果：
75.菌株h2206在初筛中，产生的木聚糖酶活力测定值为55iu/ml；优化得到其产酶条件和酶活测定条件分别是：菌株h2206最优发酵条件为以木聚糖作为碳源、硝酸铵作为氮源，在ph 7.0、28℃条件下发酵72h时酶液活性最高；菌株h2206产生的木聚糖酶的最适反应温度为55℃，最适ph为7.5。在以上条件下独立实验重复测试三次，得到菌株h2206产生的木聚糖酶活力为75iu/ml。
76.三、菌株h2206的细胞形态观察和生理生化特征检测
77.菌株h2206在28℃于pyg培养基上培养72h后，使用透射电子显微镜(日本电子jedl，jem-1400)进行细胞形态观察。菌株h2206的生长温度检测范围为4、10、28、30、32、37、40、42和45℃；生长盐浓度(nacl)检测范围为0、1、3、5、7、8、9、10％(g/100ml)；生长ph检测范围为ph 4-11之间的8个(4、5、6、7、8、9、10、11)梯度。菌株的生理生化特征使用api 50ch、api zym，以及biolog gen iii碳源等检测试剂盒检测。其他菌株生理特征，包括革兰氏染色属性、氧需求、接触酶活性、氧化酶活性、明胶水解活性，淀粉水解活性和纤维素水解活性，主要参照《放线菌系统鉴定手册》进行(xu l h(2007).actinomycete systematics:principles,methods and practices.beijing:science press,93-108.)。
78.鉴定结果显示，菌株h2206是好氧、嗜中温、耐碱菌。无气生菌丝分化，细胞呈杆状，细胞大小约为0.4-0.6μm
×
1.8-2.1μm如图1中a；部分细胞可运动。在pyg培养基上形成浅黄色菌落，如图1中b。菌落直径为0.5-1.1mm。菌株的生长温度、盐耐受以及酸碱耐受范围是10-40℃、0-8％nacl和ph 7.0-9.0，最适生长条件是28℃、0-5％ nacl、ph 7.0-8.0。菌株h2206氧化酶检测为阴性，硝酸盐还原阴性；碳源利用范围较广，能够利用多数单糖和多糖。菌株h2206与其近缘菌株的区别性生理生化特征见表1。
79.表1、菌株h2206与近缘菌株blastococcus endophyticus dsm 45413(t)及blastococcus aggregatus dsm 4725(t)的区别性特征比较表
[0080][0081]
注：+，阳性；-，阴性；w,弱阳性。
j syst evol microbiol,62:716-721.)。结果显示本发明菌株h2206与芽殖球菌属的菌种相似性最高(表3)。本发明菌株h2206的16s rrna基因序列与已知菌种的最高相似性分别是：blastococcus endophyticus dsm 45413(t)(98.34％),blastococcus aggregatus dsm 4725(t)(98.06％)。这些相似值均低于区分原核微生物物种的界限98.65％(kim m,oh hs,park sc,chun j.towards a taxonomic coherence between average nucleotide identity and 16s rrna gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes.int j syst evol microbiol2014；64:346
–
351.)。这一结果提示，菌株h2206不属于芽殖球菌属内已被认知的任何种，而是代表了芽殖球菌属的一个新物种。选取芽殖球菌属所有有效种菌株以及地嗜皮菌科中与芽殖球菌属邻近属部分种菌株的16s rrna基因序列构建系统进化树。显示菌株h2206在芽殖球菌属内与blastococcus endophyticus dsm 45413(t)(98.34％),blastococcus aggregatus dsm 4725(t)(98.06％)聚类在一个稳定的亚进化分支上(图3)。为进一步明确菌株的分类学地位，在ezbiocloud上比较并计算菌株h2206的全基因组序列与最近缘对照菌blastococcus endophyticus dsm 45413(t)的全基因组序列的平均核苷酸相似性(ani值)(yoon sh,ha sm,lim j,kwon s,chun j.a large-scale evaluation of algorithms to calculate average nucleotide identity.antonie van leeuwenhoek 2017；110:1281
–
1286.)。全基因组序列比较分析显示，菌株h2206的全基因组序列与最近缘对照菌blastococcus endophyticus dsm 45413(t)的平均核苷酸相似性(ani)80.1％。该值远低于95％这一区分原核微生物基因种的ani阈值(kim,m.,oh,h.s.,park,s.c.,and chun,j.(2014).towards a taxonomic coherence between average nucleotide identity and 16s rrna gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes.int.j.syst.evol.microbiol.64,346
–
351.)。该结果进一步支持菌株h2206代表了芽殖球菌属内一个新物种的结论。根据菌株h2206的全基因组序列计算得出菌株h2206的基因组gc含量为72.8％。
[0088]
表3、菌株h2206与其近缘菌16s rrna基因序列比对结果信息
[0089]
[0090][0091]
综合菌株h2206在表型和基因型方面的分类学数据及其与近缘菌株的比较，我们判定菌株代表了芽殖球菌属的一个新物种，命名为耐碱芽殖球菌(blastococcus alkalitolerans)。由于其可以产木聚糖酶，因此以该菌株为主成分制备的微生物菌剂，可用于食品加工，饲料添加剂，土壤调理，有机废物降解，有机肥料添加剂水产养殖等方面。
[0092]
耐碱芽殖球菌(blastococcus alkalitolerans)h2206于2022年12月7日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为cgmcc no.26165。
[0093]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。