O型、A型口蹄疫多表位二价病毒样颗粒抗原及其制备方法和应用

本发明涉及一种病毒样颗粒抗原及其制备方法和应用，特别涉及一种o型、a型口蹄疫多表位二价病毒样颗粒抗原及其制备方法和应用，本发明属于医药。

背景技术：

1、口蹄疫是由口蹄疫病毒引起主要经济畜种猪、牛、羊发病的重大动物疫病，oie将其列为必须通报的动物疫病，我国将其列为重点防范的一类动物传染病。我国采取疫苗免疫与扑杀相结合的策略防控口蹄疫。随着我国经济实力不断增强、国际地位提升，我国制定了净化和根除口蹄疫的目标。要实现此目标，安全、高效、可鉴别诊断的口蹄疫新型疫苗是不可或缺的重要技术手段，虽然采用分子生物学技术已经研制出可鉴别诊断的口蹄疫病毒标记疫苗，但生产过程中要动用活病毒，需要高级别的生产设施，生物安全风险依然存在。

2、目前，我国口蹄疫依然以o型为主，a型口蹄疫时有发生，如果使用传统灭活疫苗防控，意味着需操作两个血清型的病原用于疫苗研究和生产，不仅增加了生物风险，而且也增加了疫苗成本。利用反向疫苗学技术，以保护性抗原和/或抗原表位为材料，研发环境友好、生物安全、可鉴别诊断的高效基因工程亚单位疫苗已成为疫苗研究的新方向。目前，除了猪o型口蹄疫合成肽疫苗外，还没有口蹄疫亚单位疫苗用于疫情防控。最近，中国农业科学院兰州兽医研究所研制的o型口蹄疫病毒样颗粒疫苗获得了2个一类新兽药证书，标志着口蹄疫亚单位基因工程疫苗进入全新的时代。该疫苗以口蹄疫病毒的衣壳蛋白基因为元件，分段表达、体外组装成病毒样颗粒(virus-likeparticle,vlp)。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种o型、a型口蹄疫多表位二价病毒样颗粒抗原及其制备方法和应用。

2、为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

3、为了研发出生物安全、环境友好、免疫高效、生产工艺简单、不受动物种属使用限制的口蹄疫新型多表位疫苗。本发明以o型和a型口蹄疫病毒的保护性抗原表位为元件，设计多表位串联dna，以噬菌体ap205为骨架，利用噬菌体展示技术，将口蹄疫病毒的保护性抗原表位展示在噬菌体ap205表面，即为o型、a型口蹄疫多表位二价vlp抗原，研制o型、a型口蹄疫二价vlp通用疫苗。

4、结果显示，本发明成功将o型、a型口蹄疫病毒的串联表位展示在噬菌体表面，其形态和大小与预期大小相符，即为43nm左右的vlp；重组vlp抗原能与o型、a型口蹄疫病毒标准阳性血清发生强免疫反应，免疫反应性与fmdv灭活抗原没有明显的差异，说明o型、a型口蹄疫病毒抗原表位得到了正确的展示，能够发挥其正常的免疫学功能。用该重组vlp抗原与isa206 vg佐剂配伍试制的疫苗，免疫动物后能够诱导高水平的保护性抗体，免疫动物能够抵抗o型和a型口蹄疫病毒攻击，均100％(5/5)保护。

5、在上述研究的基础上，本发明提出了一种o型、a型口蹄疫多表位二价病毒样颗粒抗原，所述的病毒样颗粒抗原是将a型、o型口蹄疫多表位抗原序列通过间隔子序列ggggsggggs和ggsggs分别融合至噬菌体ap205的n端和c端后得到的，命名为ab2-ggggsggggs-ap205-ggsggs-ob5，其中，a型口蹄疫多表位抗原是将2个a型口蹄疫病毒毒株a/gdmm/2013和af72的vp1区的保护性抗原表位通过柔性间隔子gs连接，形成a/gdmm/2013-gs-af72嵌合基因结构，命名为ab2；o型口蹄疫多表位抗原是将o型5个拓扑型的代表毒株o/tibet/cha/99，o/mya98/by/2010，o/hn/cha/93、o/xjps/cha/2017和cathay型vp1区的保护性抗原表位通过柔性间隔子gs顺序连接而成，形成o/tibet/cha/99-o/mya98-o/hn/cha/93-o/xjps/cha/2017-cathay多表位串联结构形式，命名为ob5。

6、其中，优选的，ob5的氨基酸序列如seq id no.2所示；ab2的氨基酸序列如seq idno.4所示。

7、其中，优选的，所述的病毒样颗粒抗原的氨基酸序列如seq id no.6所示。

8、编码所述的o型、a型口蹄疫多表位二价病毒样颗粒抗原的核酸也在本发明的保护范围之内。优选的，所述的核酸的核苷酸序列如seq id no.5所示。

9、进一步的，本发明还提出了一种制备所述的o型、a型口蹄疫多表位二价病毒样颗粒抗原的方法，包括以下步骤：

10、(1)o型口蹄疫病毒多表位基因的设计

11、根据o型5个拓扑型的代表毒株o/tibet/cha/99，o/mya98/by/2010，o/hn/cha/93、o/xjps/cha/2017和cathay型vp1基因编码氨基酸序列，选择口蹄疫病毒vp1区的保护性抗体的线性抗原表位，在相邻表位之间引入柔性间隔子gs，然后顺序连接5个表位，形成o/tibet/cha/99-o/mya98-o/hn/cha/93-o/xjps/cha/2017-cathay多表位串联结构形式，命名为ob5；

12、(2)a型口蹄疫病毒多表位基因的设计

13、将2个a型口蹄疫病毒毒株a/gdmm/2013和af72的vp1区的保护性抗原表位通过柔性间隔子gs连接，形成a/gdmm/2013-gs-af72嵌合基因结构，命名为ab2；

14、(3)重组表达质粒的构建、蛋白表达及纯化

15、将上述设计的ab2和ob5序列分别融合至噬菌体ap205的n端和c端，并在3个基因间引入两种间隔子序列ggggsggggs和ggsggs，形成ab2-ggggsggggs-ap205-ggsggs-ob5结构形式，同时在该人工基因的5′-端和3′-端引入特异性酶切位点bamh 1和xho l；人工合成后，将其插入用bamh1和xho l线性化的pet-28a(+)载体，构建重组表达质粒pet-28/ab2/ap205/ob5重组表达质粒，转化jm109感受态，通过抗性筛选、双酶切和序列分析鉴定阳性重组表达质粒；

16、采用热激发将上述阳性重组表达质粒转化bl21(de3)plyss，挑单菌落接种5ml含卡那霉素的lb培养液，37℃、220rmp培养过夜；取过夜培养物，按1％(v/v)加入新制备的含卡那霉素的无菌lb培养液中，37℃220rmp培养，当od600nm≈0.4～0.6时，加入1mm的iptg，37℃继续培养4～6小时，4000rpm离心20min收获培养物，用蛋白裂解液重悬沉淀，超声破碎，20000g离心20min收集上清，弃沉淀，按照ni-nta组氨酸纯化柱说明书纯化蛋白，即得。

17、其中，优选的，ob5的核苷酸序列如seq id no.1所示；ab2的核苷酸序列如seq idno.3所示。

18、其中，优选的，ab2-ggggsggggs-ap205-ggsggs-ob5的核苷酸序列如seq id no.5所示。

19、更进一步的，本发明还提出了所述的o型、a型口蹄疫多表位二价病毒样颗粒抗原在制备预防o型以及a型口蹄疫疫苗中的用途。

20、更进一步的，本发明还提出了一种o型、a型口蹄疫多表位二价病毒样颗粒疫苗，所述的疫苗中含有本发明所述的o型、a型口蹄疫多表位二价病毒样颗粒抗原以及佐剂。

21、其中，优选的，所述的佐剂为isa206 vg。

22、相较于现有技术，本发明的有益效果是：

23、本发明提出了一种o型、a型口蹄疫多表位二价病毒样颗粒抗原，该重组vlp抗原能与o型、a型口蹄疫病毒标准阳性血清发生强免疫反应，免疫反应性与fmdv灭活抗原没有明显的差异，说明o型、a型口蹄疫病毒抗原表位得到了正确的展示，能够发挥其正常的免疫学功能。用该重组vlp抗原与isa206 vg佐剂配伍试制的疫苗，免疫动物后能够诱导高水平的保护性抗体，免疫动物能够抵抗o型和a型口蹄疫病毒攻击，均100％(5/5)保护。

24、本发明研发的o型、a型口蹄疫多表位二价vlp疫苗，不仅o型、a型口蹄疫病毒保护性抗原的正确展示和良好的免疫功能，且克服了使用动物种属特异性载体蛋白，导致疫苗仅适用特定种属动物的限制性问题。此外，多个毒株抗原表位串联解决了单个口蹄疫病毒毒株抗原谱单一，针对抗原变异毒株不能提供免疫保护的问题。更重要的是，只生产一种抗原即可预防猪牛羊o型、a型口蹄疫两个血清型，实现了“一针防两病”的目的，解决企业最为关心的生产工艺和成本问题。因此，该疫苗可以说是一种具有广阔前景的新型疫苗，将对我国净化和根除o型、a型口蹄疫，实现免疫无口蹄疫地位具有十分重要的意义。