线粒体富集的细胞的识别的制作方法

本发明大体上涉及富集有线粒体的细胞，并且更确切地说，涉及识别线粒体富集的细胞的方法。

背景技术：

1、线粒体的主要功能是通过电子传递链和氧化磷酸化系统(“呼吸链”)生成作为三磷酸腺苷(atp)的能量。此外，线粒体在真核细胞中执行许多基本任务，例如丙酮酸氧化、克雷布斯循环(krebs cycle)以及氨基酸、脂肪酸和类固醇的代谢。线粒体参与的其它过程包括产热、钙离子储存、钙信号传导、程序性细胞死亡(细胞凋亡)和细胞增殖。

2、细胞内的atp浓度通常为1-10mm。atp可以使用单糖和复合糖(碳水化合物)或脂类作为能源通过氧化还原反应产生。对于要合成为atp的复杂燃料，它们首先需要分解成更小、更简单的分子。复合碳水化合物被水解成单糖，如葡萄糖和果糖。脂肪(甘油三酯)被代谢产生脂肪酸和甘油。

3、将葡萄糖氧化成二氧化碳的整个过程被称为细胞呼吸，并且可以从单个葡萄糖分子产生约30个atp分子。atp可以通过许多不同的细胞过程产生。用于在真核生物中生成能量的三种主要途径是糖酵解和柠檬酸循环/氧化磷酸化(两者均为细胞呼吸的组分)以及β-氧化。由非光合真核生物造成的这种atp产生大部分发生在线粒体中，这些线粒体可占典型细胞总体积的将近25％。

4、已经报道了诱导线粒体转移到宿主细胞或组织中的尝试。大多数方法需要通过注射主动转移线粒体。在如脂质体之类的载体内吞噬的线粒体的转移也是已知的。已显示，mtdna转移可在体外细胞之间自发地发生。此外，线粒体转移已在体外通过内吞作用或内化证实。

5、已显示，线粒体富集的细胞适用于治疗疾病和病症，确切地说为线粒体相关病症。因此，需要识别或检测富集有外源性线粒体的细胞的方法。

技术实现思路

1、本发明提供识别或检测富集有外源性线粒体的细胞的方法。本发明还提供用于识别或检测线粒体富集的细胞的试剂盒。

2、在一个实施例中，本发明提供一种通过使细胞与代谢底物接触并且在与所述代谢底物接触之后确定所述细胞中的电子转移来确定细胞富集有外源性线粒体的方法。在一个方面中，所述细胞富集有胎盘线粒体或来源于血液的线粒体。在某些方面中，所述细胞为干细胞、祖细胞或骨髓来源的干细胞、多能干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、造血祖细胞、髓样祖细胞、淋巴样祖细胞、巨核细胞、红细胞、肥大细胞、成肌细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤(nk)细胞、小淋巴细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞、浆细胞、网状细胞、髓细胞生成细胞、红细胞生成细胞或其任何组合。在各种方面中，所述细胞为cd34+细胞。在一个方面中，所述代谢底物为色胺、d,l-a-甘油po4、琥珀酸盐或其组合。在另一个方面中，利用色胺的酶位于线粒体中或结合于线粒体膜。在另一个方面中，所述细胞通过使所述细胞与外源性线粒体接触来富集。在一个方面中，比色分析通过吸光度进行测量并且增加的吸光度指示细胞富集。在另一方面中，使所述细胞与所述代谢底物接触产生nadh和/或fadh2。

3、在另一实施例中，本发明提供一种通过确定细胞中的单胺氧化酶a(mao-a)和/或单胺氧化酶b(mao-b)的水平来确定细胞富集有胎盘线粒体的方法，其中与未富集的细胞相比，富集有胎盘线粒体的细胞具有增加的mao-a和/或mao-b水平。在一个方面中，所述细胞为干细胞、祖细胞或骨髓来源的干细胞、多能干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、造血祖细胞、髓样祖细胞、淋巴样祖细胞、巨核细胞、红细胞、肥大细胞、成肌细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤(nk)细胞、小淋巴细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞、浆细胞、网状细胞、髓细胞生成细胞、红细胞生成细胞或其任何组合。在某些方面中，所述细胞为cd34+细胞。在另一方面中，所述细胞通过使所述细胞与线粒体接触来富集。在另一方面中，通过质谱法确定mao-a和/或mao-b水平。

4、在另一实施例中，本发明提供一种通过确定甘油-3-磷酸脱氢酶的水平来确定细胞富集有外源性线粒体的方法，其中与未富集的细胞相比，富集有线粒体的细胞具有增加的线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶水平。在一个方面中，所述细胞为干细胞、祖细胞或骨髓来源的干细胞、多能干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、造血祖细胞、髓样祖细胞、淋巴样祖细胞、巨核细胞、红细胞、肥大细胞、成肌细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤(nk)细胞、小淋巴细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞、浆细胞、网状细胞、髓细胞生成细胞、红细胞生成细胞或其任何组合。在各种方面中，所述细胞为cd34+细胞。在另一方面中，所述细胞通过使所述细胞与线粒体接触来富集。在各种方面中，所述细胞富集有胎盘线粒体或来源于血液的线粒体。

5、在一个实施例中，本发明提供一种具有代谢底物和使用说明书的试剂盒，其用于识别富集有外源性线粒体的细胞。在一个方面中，底物为色胺、d,l-a-甘油po4或其组合。在另一方面中，线粒体为胎盘线粒体或来源于血液的线粒体。

6、在一个实施例中，本发明提供一种确定细胞富集有外源性线粒体的方法，其通过比色分析确定所述细胞与代谢底物接触之后的线粒体富集，确定所述细胞中的单胺氧化酶a(mao-a)和/或单胺氧化酶b(mao-b)的水平，和/或确定所述细胞中的甘油-3-磷酸脱氢酶的水平，其中与不富集有线粒体的细胞相比，富集有线粒体的细胞分别具有增加的单胺氧化酶a(mao-a)水平、增加的单胺氧化酶b(mao-b)水平和/或增加的甘油-3-磷酸脱氢酶水平；其中所述比色分析通过吸光度进行测量并且其中吸光度的增加指示线粒体富集。

技术特征：

1.一种确定细胞富集有外源性线粒体的方法，其包含：

2.根据权利要求1所述的方法，其中确定所述电子转移是通过比色分析、荧光分析、发光分析或耗氧量来进行的。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞富集有胎盘线粒体或来源于血液的线粒体。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述细胞富集有胎盘线粒体。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞选自由以下组成的群组：干细胞、祖细胞或骨髓来源的干细胞、多能干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、造血祖细胞、髓样祖细胞、淋巴样祖细胞、巨核细胞、红细胞、肥大细胞、成肌细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤(nk)细胞、小淋巴细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞、浆细胞、网状细胞、髓细胞生成细胞、红细胞生成细胞和其任何组合。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞为cd34+细胞。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述代谢底物选自由色胺、d,l-a-甘油po4、琥珀酸盐和其组合组成的群组。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述代谢底物为色胺。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述代谢底物为琥珀酸盐。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞通过使所述细胞与外源性线粒体接触来富集。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述比色分析通过吸光度进行测量。

12.根据权利要求11所述的方法，其中增加的吸光度指示所述细胞富集。

13.根据权利要求1所述的方法，其中使所述细胞与所述代谢底物接触产生nadh和/或fadh2。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述线粒体为新鲜的、冻融的或其任何组合。

15.一种确定细胞富集有胎盘线粒体的方法，其包含确定所述细胞中的单胺氧化酶a(mao-a)和/或单胺氧化酶b(mao-b)的水平，其中与不富集有线粒体的细胞相比，富集有胎盘线粒体的细胞具有增加的mao-a和/或mao-b水平。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞选自由以下组成的群组：干细胞、祖细胞或骨髓来源的干细胞、多能干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、造血祖细胞、髓样祖细胞、淋巴样祖细胞、巨核细胞、红细胞、肥大细胞、成肌细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤(nk)细胞、小淋巴细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞、浆细胞、网状细胞、髓细胞生成细胞、红细胞生成细胞和其任何组合。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞为cd34+细胞。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述细胞通过使所述细胞与线粒体接触来富集。

19.根据权利要求15所述的方法，其中通过质谱法确定所述mao-a和/或mao-b水平。

20.一种用于确定细胞富集有外源性线粒体的方法，其包含确定甘油-3-磷酸脱氢酶的水平，其中与不富集有线粒体的细胞相比，富集有线粒体的细胞具有增加的甘油-3-磷酸脱氢酶水平。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞选自由以下组成的群组：干细胞、祖细胞或骨髓来源的干细胞、多能干细胞、胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、造血祖细胞、髓样祖细胞、淋巴样祖细胞、巨核细胞、红细胞、肥大细胞、成肌细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤(nk)细胞、小淋巴细胞、t淋巴细胞、b淋巴细胞、浆细胞、网状细胞、髓细胞生成细胞、红细胞生成细胞和其任何组合。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述细胞为cd34+细胞。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞通过使所述细胞与线粒体接触来富集。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述细胞富集有胎盘线粒体或来源于血液的线粒体。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述细胞富集有胎盘线粒体。

26.一种用于识别富集有外源性线粒体的细胞的试剂盒，其包含：

27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述底物选自由色胺、d,l-a-甘油po4、琥珀酸盐和其组合组成的群组。

28.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述线粒体为胎盘线粒体或来源于血液的线粒体。

29.一种确定细胞富集有外源性线粒体的方法，其包含：

技术总结
本公开基于富集有线粒体的细胞对治疗疾病和病症有用的发现。本发明提供识别或检测富集有外源性线粒体的此类细胞的方法。具体来说，富集有线粒体的细胞的识别或检测是通过利用底物，如色胺来进行确定。这包括确定单胺氧化酶A(MAO‑A)、单胺氧化酶B(MAO‑B)、甘油‑3‑磷酸脱氢酶或其组合的水平。本发明还提供用于识别或检测线粒体富集的细胞的试剂盒。

技术研发人员：N·伊夫吉-奥哈纳,N·谢尔
受保护的技术使用者：米诺维亚治疗公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15