人肝实质细胞的培养方法、培养人肝实质细胞、培养基及其制造方法、人肝非实质细胞的培养上清的制造方法与流程

本发明涉及人肝实质细胞的培养方法、由该方法得到的培养人肝实质细胞、该方法中使用的培养基及其制造方法、以及人肝非实质细胞的培养上清的制造方法。

背景技术：

1、在医药品开发的药代动力学试验中，进行了使用啮齿类的体内试验、使用啮齿类来源的肝细胞(肝实质细胞)的体外试验。然而，在啮齿类或其细胞的试验中，存在种属差异，因此难以预测人特异性产生的毒性。另一方面，原代人肝细胞难以稳定地得到医药品开发的药代动力学试验所需的量。因此，要求由原代人肝细胞构建可长期培养的增殖性优异的肝细胞株(主细胞系)。

2、肝有机质是由肝细胞培养的肝细胞培养物，被期待成为用于医药品开发的稳定的肝细胞供给源。已经开发出了用于构建肝有机质的改良方法。专利文献1中公开了一种使用包含上皮生长因子(egf)、notch抑制剂和转化生长因子β(tgf－β)抑制剂的培养基、或者包含egf、bmp抑制剂和wnt激动剂的培养基而得的人肝有机质的制造方法。

3、现有技术文献

4、专利文献

5、专利文献1：美国专利申请公开第2018/0066233号说明书

技术实现思路

1、本发明提供可长期培养的增殖性优异的人肝实质细胞的培养方法、由该方法制造的培养人肝实质细胞、以及该方法中使用的培养基。另外，本发明提供一种人肝非实质细胞的培养上清的制造方法。

2、本发明包含以下的实施方式。

3、〔1〕一种人肝实质细胞的培养方法，包含如下步骤：将人肝实质细胞用含有人肝非实质细胞的培养上清、wnt信号传导促进剂和促细胞分裂生长因子的培养基进行培养。

4、〔2〕根据〔1〕所述的方法，其中，上述wnt信号传导促进剂含有wnt家族成员蛋白。

5、〔3〕根据〔2〕所述的方法，其中，上述wnt信号传导促进剂进一步含有r－spondin超家族蛋白。

6、〔4〕根据〔1〕～〔3〕中任一项所述的方法，其中，上述促细胞分裂生长因子含有选自上皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)和肝细胞生长因子(hgf)中的1种以上。

7、〔5〕根据〔1〕～〔4〕中任一项所述的方法，其中，上述培养基进一步含有选自rho激酶(rock)信号传导抑制剂、转化生长因子β(tgf－β)信号传导抑制剂和白细胞介素－6(il－6)家族细胞因子中的1种以上。

8、〔6〕根据〔5〕所述的方法，其中，上述培养基含有rock信号传导抑制剂。

9、〔7〕根据〔5〕或〔6〕所述的方法，其中，上述培养基含有tgf－β信号传导抑制剂。

10、〔8〕根据〔5〕～〔7〕中任一项所述的方法，其中，上述培养基含有il－6家族细胞因子。

11、〔9〕根据〔1〕～〔8〕中任一项所述的方法，其中，上述培养基进一步含有选自视黄酸、烟酰胺、camp活性剂、胃泌素、神经生物系统补充剂和抗氧化剂中的1种以上。

12、〔10〕根据〔1〕～〔9〕中任一项所述的方法，其中，通过将人肝非实质细胞用含有wnt信号传导促进剂和促细胞分裂生长因子的人肝非实质细胞培养用培养基进行培养，并从该培养后的培养基中分离上清来制造上述人肝非实质细胞的培养上清。

13、〔11〕根据〔10〕所述的方法，其中，上述人肝非实质细胞培养用培养基进一步含有rock信号传导抑制剂。

14、〔12〕根据〔10〕或〔11〕所述的方法，其中，上述人肝非实质细胞培养用培养基进一步含有选自il－6家族细胞因子、tgf－β信号传导抑制剂、视黄酸、烟酰胺、camp活性剂、胃泌素、神经生物系统补充剂和抗氧化剂中的1种以上。

15、〔13〕一种培养人肝实质细胞，是通过上述〔1〕～〔12〕中任一项所述的方法进行培养而得的。

16、〔14〕一种培养基，含有人肝非实质细胞的培养上清、wnt信号传导促进剂和促细胞分裂生长因子。

17、〔15〕一种人肝非实质细胞的培养上清的制造方法，包含如下步骤：

18、将人肝非实质细胞用含有wnt信号传导促进剂和促细胞分裂生长因子的培养基进行培养，以及

19、从该培养后的培养基中分离上清。

20、〔16〕一种培养基的制造方法，包含如下步骤：将由上述〔15〕所述的方法制造的人肝非实质细胞的培养上清、wnt信号传导促进剂和促细胞分裂生长因子进行混合。

21、本发明提供一种可长期培养的增殖性优异的人肝实质细胞的培养方法。根据本发明，能够稳定地提供对医药品开发等有用的人肝实质细胞。

1.一种人肝实质细胞的培养方法，包含如下步骤：将人肝实质细胞用含有人肝非实质细胞的培养上清、wnt信号传导促进剂和促细胞分裂生长因子的培养基进行培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述wnt信号传导促进剂含有wnt家族成员蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述wnt信号传导促进剂进一步含有r－spondin超家族蛋白。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述促细胞分裂生长因子含有选自上皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)和肝细胞生长因子(hgf)中的1种以上。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述培养基进一步含有选自rho激酶(rock)信号传导抑制剂、转化生长因子β(tgf－β)信号传导抑制剂和白细胞介素－6(il－6)家族细胞因子中的1种以上。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述培养基含有rock信号传导抑制剂。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述培养基含有tgf－β信号传导抑制剂。

8.根据权利要求5～7中任一项所述的方法，其中，所述培养基含有il－6家族细胞因子。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述培养基进一步含有选自视黄酸、烟酰胺、camp活性剂、胃泌素、神经生物系统补充剂和抗氧化剂中的1种以上。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，通过将人肝非实质细胞用含有wnt信号传导促进剂和促细胞分裂生长因子的人肝非实质细胞培养用培养基进行培养，从该培养后的培养基中分离上清来制造所述人肝非实质细胞的培养上清。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述人肝非实质细胞培养用培养基进一步含有rock信号传导抑制剂。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述人肝非实质细胞培养用培养基进一步含有选自il－6家族细胞因子、tgf－β信号传导抑制剂、视黄酸、烟酰胺、camp活性剂、胃泌素、神经生物系统补充剂和抗氧化剂中的1种以上。

13.一种培养人肝实质细胞，是通过权利要求1～12中任一项所述的方法进行培养而得的。

14.一种培养基，含有人肝非实质细胞的培养上清、wnt信号传导促进剂和促细胞分裂生长因子。

15.一种人肝非实质细胞的培养上清的制造方法，包含如下步骤：

16.一种培养基的制造方法，包含如下步骤：将由权利要求15所述的方法制造的人肝非实质细胞的培养上清、wnt信号传导促进剂和促细胞分裂生长因子进行混合。