重组AAV载体的制造和使用的制作方法

背景技术：

1、由功能异常基因引起的遗传疾病占全球疾病的很大一部分。基因疗法正成为一种有前景的治疗形式，旨在减轻遗传疾病的影响。

技术实现思路

1、本公开提供了用于改进病毒载体(包括aav载体)的设计和/或生产的方法和技术。根据各种实施方案，本公开提供如下见解：表达构建体(例如质粒)的某些设计元件和/或转染条件可显著影响病毒(例如aav)生产的一种或多种特性和/或特征(包括例如病毒载体产量、包装效率和/或复制胜任型aav水平中的一者或多者)。

2、本公开尤其证明具有序列元件(例如rep基因或基因变体、cap基因或基因变体、一种或多种辅助病毒基因或基因变体和/或一种或多种所关注基因)的特定组合的双质粒转染系统可有效地增强下游生产，尤其是用于基因疗法的病毒载体。例如，在一些实施方案中，本公开提供如下见解：具有野生型序列元件(例如rep基因或基因变体、一种或多种辅助病毒基因或基因变体、一种或多种病毒启动子)的特定组合的双质粒转染系统可有效地增强病毒载体生产。

3、在一些实施方案中，本公开证明具有特定序列元件组合的双质粒转染系统可与各种转染试剂(例如化学转染试剂，包括脂质、聚合物和阳离子分子[例如一种或多种阳离子脂质])组合，可有效地增强病毒载体生产。

4、在一些实施方案中，本公开提供如下见解：优化双质粒系统中的质粒比可进一步改进病毒载体，例如aav载体的一个或多个方面(包括例如病毒载体产量、包装效率和/或复制胜任型aav水平中的一者或多者)的生产。不希望受任何特定理论束缚，本公开证明相对于参考，用双质粒系统转染可产生提高的病毒载体产量，所述双质粒系统包含具有病毒辅助基因(例如腺病毒基因或疱疹病毒基因)和aav rep基因或aav cap基因的第一质粒，和具有有效负载和aav rep基因或aav cap基因的第二质粒。在一些实施方案中，本公开证明，与具有有效负载的第二质粒相比，包含大量具有辅助病毒基因的第一质粒的特定转染比可产生相对于参考提高的病毒载体产量和包装效率。

5、在一些实施方案中，本公开提供了质粒，包括编码aav cap基因的多核苷酸序列、编码aav rep基因的多核苷酸序列、编码有效负载和侧接itr的多核苷酸序列和/或编码一个或多个病毒辅助基因的多核苷酸序列中的至少一者。在一些实施方案中，提供的质粒还包括编码启动子例如天然p5启动子、天然p40启动子、cmv启动子和/或一种或多种野生型启动子的多核苷酸序列。在一些实施方案中，提供的质粒还包括polya序列。在一些实施方案中，提供的质粒还包括内含子，例如启动子与aav rep基因之间的内含子。在一些实施方案中，提供的质粒还包含编码野生型病毒辅助基因的多核苷酸序列。在一些实施方案中，提供的质粒还包含转基因，例如丙酰辅酶a羧化酶、atp7b、因子ix、甲基丙二酰辅酶a变位酶(mut)、α1-抗胰蛋白酶(a1at)、ugt1a1或其变体中的一者或多者。在一些实施方案中，提供的质粒不包括编码核酸酶的多核苷酸序列。

6、在一些实施方案中，第一和第二所提供质粒存在于组合物中，其中每个质粒包括不同序列元件(例如，编码aav cap基因的多核苷酸序列、编码aav rep基因的多核苷酸序列、编码有效负载和侧接itr的多核苷酸序列和/或编码一个或多个病毒辅助基因的多核苷酸序列)。在一些实施方案中，提供的组合物包括包含编码aav cap基因的多核苷酸序列的第一质粒和包含编码aav rep基因的多核苷酸序列的第二质粒。在一些实施方案中，提供的组合物包括包含编码有效负载和侧接itr的多核苷酸序列的第一质粒和包含编码一个或多个病毒辅助基因的多核苷酸序列的第二质粒。在一些实施方案中，提供的组合物包括包含编码一个或多个病毒辅助基因的多核苷酸序列的第一质粒和包含编码有效负载和侧接itr的多核苷酸序列的第二质粒。在一些实施方案中，提供的组合物经配制以用于将第一和第二质粒共递送至细胞。在一些实施方案中，提供的组合物包括特定比率的第一和第二质粒以达到两种质粒之间的特定比率。在一些实施方案中，相对于第二质粒，提供的组合物包括更大量的第一质粒。在一些实施方案中，提供的组合物包括第一和第二质粒，其中第一质粒与第二质粒的比为大于或等于1.5∶1直至10∶1。在一些实施方案中，提供的组合物包括包含编码一个或多个病毒辅助基因的多核苷酸序列的第一质粒和包含编码有效负载和侧接itr的多核苷酸序列的第二质粒。在一些实施方案中，提供的组合物包括包含编码一个或多个病毒辅助基因和rep基因的多核苷酸序列的第一质粒和包含编码有效负载和侧接itr和cap基因的多核苷酸序列的第二质粒。在一些实施方案中，提供的组合物包括包含编码一个或多个病毒辅助基因和cap基因的多核苷酸序列的第一质粒和包含编码有效负载和侧接itr和rep基因的多核苷酸序列的第二质粒。

7、在一些实施方案中，提供的组合物包括以下中的一者或多者：编码一个或多个增强子序列的多核苷酸序列、编码一个或多个启动子序列的多核苷酸序列、编码一个或多个内含子序列的多核苷酸序列、编码基因的多核苷酸序列和包含polya序列的多核苷酸序列。在一些实施方案中，提供的编码有效负载的多核苷酸序列包括包含第一核酸序列和第二核酸序列的多核苷酸序列，其中第一核酸序列包含至少一个基因并且第二核酸序列位于第一核酸序列的5′或3′并且在整合至目标整合位点后促进两种独立基因产物的产生，第三核酸序列，其位于多核苷酸的5′并且包含与位于目标整合位点的5′的基因组序列同源的序列，以及第四核酸序列，其位于多核苷酸的3′并且包含与位于目标整合位点的3′的基因组序列同源的序列。在一些实施方案中，提供的目标整合位点包含内源基因的3′端。在一些实施方案中，提供的第三核酸序列与内源基因中终止密码子上游的dna序列同源。在一些实施方案中，提供的第四核酸序列与内源基因中终止密码子下游的dna同源。在一些实施方案中，提供的目标整合位点位于细胞的基因组中。在一些实施方案中，提供的目标整合位点位于肝细胞、肌细胞或cns细胞的基因组中。

8、在一些实施方案中，提供的组合物包括用于包装aav载体的组合物。在一些实施方案中，提供的组合物用于制造包装的aav载体的方法中。在一些实施方案中，将提供的组合物递送至细胞，包括哺乳动物细胞、肝细胞、肌细胞、cns细胞或从受试者分离的细胞。在一些实施方案中，提供的组合物通过化学转染试剂(包括阳离子分子和/或阳离子脂质)递送至细胞。在一些实施方案中，提供的组合物包括经包装aav载体组合物。在一些实施方案中，提供的组合物可在治疗方法中施用至有需要的受试者，包括患有或疑似患有以下中的一者或多者的受试者：丙酸血症、威尔逊病(wilson′s disease)、血友病、克里格勒-纳贾尔综合征(crigler-najjar syndrome)、甲基丙二酸血症(mma)、α-1抗胰蛋白酶缺乏症(a1atd)、糖原贮积病(gsd)、杜氏肌营养不良(duchenne′s muscular dystrophy)、肢带肌营养不良、x连锁肌管肌病、帕金森病、粘多糖贮积症、血友病a、血友病b或遗传性血管性水肿(hae)。在一些实施方案中，提供的组合物不包含核酸酶。