抗GPC3抗体、多特异性抗体和使用方法与流程

本披露涉及与gpc3结合的抗体和抗体衍生物及其使用方法。在某些实施例中，抗体衍生物是与gpc3和额外抗原(例如4-1bb)结合的多特异性抗体。

背景技术：

1、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc3)是一种gpi连接的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和细胞表面癌胚蛋白，在超过70％的肝细胞癌(hcc)活检中高度表达。gpc3阳性hcc患者的无病存活率显著低于gpc3阴性hcc患者。gpc3也以可溶性gpc3(sgpc3)的形式存在于hcc患者的外周血中，但不存在于健康成人的肝组织、脂肪肝的病理样品或肝硬化、肝炎或损伤的肝脏中，这表明gpc3是比甲胎蛋白(afp)更可靠的肿瘤标记物。gpc3还在多种儿科癌症上表达，例如肝细胞癌、大多数儿科肝母细胞瘤、肾母细胞瘤、横纹肌样瘤、某些生殖细胞肿瘤亚型和少数横纹肌肉瘤。此外，gpc3基因突变导致辛普森变异综合征(simpson-golabi-behmelsyndrome)，这是一种x连锁过度生长疾病，易发展为表达gpc3的癌症，包括肝母细胞瘤和肾母细胞瘤。因此，本领域需要开发靶向gpc3用于癌症治疗的治疗分子和方法。

2、4-1bb(也称为cd137和tnfrsf9)是肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrs)的跨膜蛋白。4-1bb存在于各种免疫细胞中，包括活化的nk和nkt细胞、t细胞和树突状细胞(dc)。对鼠和人t细胞的研究表明，4-1bb可以促进细胞增殖、存活和细胞因子产生。此外，4-1bb激动剂抗体可以增加共刺激分子表达并增强溶细胞性t淋巴细胞应答，从而在各种模型中产生抗肿瘤功效。

3、单克隆抗体、抗体-药物缀合物、双特异性抗体、溶细胞性t淋巴细胞和car t细胞已被描述为潜在的治疗选择。其中，抗gpc3/cd3双特异性t细胞重定向抗体(例如ery974)已被引入并在临床前动物模型和人类试验中进行了测试。然而，本领域仍然需要安全有效的抗gpc3单特异性和多特异性抗体来治疗gpc3相关癌症。

技术实现思路

1、本披露提供了以高亲和力特异性结合gpc3的分离的单克隆抗体和抗体衍生物，包括单特异性抗gpc3抗体和结合gpc3和一种或多种另外的靶标的多特异性抗体。在某些实施例中，本文披露的抗体或抗体衍生物包含与gpc3结合的单结构域抗体。本披露还提供了制备和使用本文披露的抗体和抗体衍生物以及包含这些抗体和抗体衍生物的药物组合物的方法，例如用于治疗疾病和障碍，例如癌症。本发明部分基于与gpc3结合的新型单结构域抗体的发现，该抗体可以靶向肿瘤细胞和/或增加针对肿瘤细胞的免疫应答，从而提供改进的抗肿瘤功效。

2、本披露提供了一种与gpc3和4-1bb结合的多特异性抗体。在某些实施例中，该多特异性抗体包含：i)第一抗原结合部分，其包含含有与gpc3结合的单结构域抗体的抗gpc3抗体；和ii)第二抗原结合部分，其包含与4-1bb结合的抗4-1bb抗体。

3、在某些实施例中，单结构域抗体包含vhh。在某些实施例中，单结构域抗体或vhh包含重链可变区(vh)。在某些实施例中，单结构域抗体以1x10-7m或更小的kd与gpc3结合。在某些实施例中，单结构域抗体以5x10-8m或更小的kd与gpc3结合。在某些实施例中，单结构域抗体以1x10-8m或更小的kd与gpc3结合。在某些实施例中，单结构域抗体以约1x10-10m至约5x10-8m的kd与gpc3结合。

4、在某些实施例中，该单结构域抗体与包含重链可变区的参考单结构域抗体交叉竞争结合gpc3，该重链可变区包含：包含seq id no:1中所示氨基酸序列的重链可变区cdr1，包含seq id no:2中所示氨基酸序列的重链可变区cdr2，和包含seq id no:3中所示氨基酸序列的重链可变区cdr3，或包含seq id no:5中所示氨基酸序列的重链可变区cdr1，包含seq id no:6中所示氨基酸序列的重链可变区cdr2，和包含seq id no:7中所示氨基酸序列的重链可变区cdr3。在某些实施例中，单结构域抗体包含重链可变区，该重链可变区包含：a)重链可变区cdr1，其包含seq idno:1和5中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体；b)重链可变区cdr2，其包含seq id no:2和6中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体；和c)重链可变区cdr3，其包含seq id no:3和7中任一个的氨基酸序列，或该氨基酸序列的包含至多约3个氨基酸取代的变体。在某些实施例中，该单结构域抗体包含重链可变区，该重链可变区包含cdr1结构域、cdr2结构域和cdr3结构域，其中该cdr1结构域、该cdr2结构域和该cdr3结构域分别包含参考重链可变区中包含的cdr1结构域、cdr2结构域和cdr3结构域，该参考重链可变区包含选自由seq id no:4、8和12组成的组的氨基酸序列。在某些实施例中，该单结构域抗体包含含有seq id no:1中所示氨基酸序列的重链可变区cdr1，含有seq id no:2中所示氨基酸序列的重链可变区cdr2，和含有seq id no:3中所示氨基酸序列的重链可变区cdr3。在某些实施例中，该单结构域抗体包含含有seq id no:5中所示氨基酸序列的重链可变区cdr1，含有seq id no:6中所示氨基酸序列的重链可变区cdr2，和含有seq id no:7中所示氨基酸序列的重链可变区cdr3。在某些实施例中，该单结构域抗体包含重链可变区，该重链可变区包含与选自由seq id no:4、8和12组成的组的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，该单结构域抗体包含重链可变区，该重链可变区包含seq id no:4中所示氨基酸序列。在某些实施例中，该单结构域抗体包含重链可变区，该重链可变区包含seq id no:8中所示氨基酸序列。在某些实施例中，该单结构域抗体包含重链可变区，该重链可变区包含seq id no:12中所示氨基酸序列。在某些实施例中，该单结构域抗体包含人源化框架。

5、在某些实施例中，第二抗原结合部分包含与参考抗4-1bb抗体交叉竞争的抗4-1bb抗体，该抗体包含：a)重链可变结构域(vh)序列，其包含：(1)包含seq id no:51中所示氨基酸序列的cdr-h1，(2)包含seq id no:52中所示氨基酸序列的cdr-h2，和(3)包含seq idno:53中所示氨基酸序列的cdr-h3；和轻链可变结构域(vl)序列，其包含：(1)包含seq idno:54中所示氨基酸序列的cdr-l1，(2)包含seq id no:55中所示氨基酸序列的cdr-l2，和(3)包含seq id no:56中所示氨基酸序列的cdr-l3；或b)重链可变结构域(vh)序列，其包含：(1)包含seq id no:61中所示氨基酸序列的cdr-h1，(2)包含seq id no:62中所示氨基酸序列的cdr-h2，和(3)包含seq id no:63中所示氨基酸序列的cdr-h3；和轻链可变结构域(vl)序列，其包含：(1)包含seq id no:64中所示氨基酸序列的cdr-l1，(2)包含seq id no:65中所示氨基酸序列的cdr-l2，和(3)包含seq id no:66中所示氨基酸序列的cdr-l3。在某些实施例中，第二抗原结合部分包含：重链可变结构域(vh)序列，其包含：(1)包含seq idno:51中所示氨基酸序列的cdr-h1，(2)包含seq id no:52中所示氨基酸序列的cdr-h2，和(3)包含seq id no:53中所示氨基酸序列的cdr-h3；和轻链可变结构域(vl)序列，其包含：(1)包含seq id no:54中所示氨基酸序列的cdr-l1，(2)包含seq id no:55中所示氨基酸序列的cdr-l2，和(3)包含seq id no:56中所示氨基酸序列的cdr-l3。在某些实施例中，第二抗原结合部分包含：重链可变结构域(vh)序列，其包含：(1)包含seq id no:61中所示氨基酸序列的cdr-h1，(2)包含seq id no:62中所示氨基酸序列的cdr-h2，和(3)包含seq idno:63中所示氨基酸序列的cdr-h3；和轻链可变结构域(vl)序列，其包含：(1)包含seq idno:64中所示氨基酸序列的cdr-l1，(2)包含seq id no:65中所示氨基酸序列的cdr-l2，和(3)包含seq id no:66中所示氨基酸序列的cdr-l3。在某些实施例中，第二抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含seq id no:57中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含seq id no:58中所示氨基酸序列。在某些实施例中，第二抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含seq id no:67中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含seq id no:68中所示氨基酸序列。在某些实施例中，第二抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包含seq id no:77中所示氨基酸序列，该轻链可变区包含seq id no:78中所示氨基酸序列。在某些实施例中，抗4-1bb抗体包含人源化抗体。

6、在某些实施例中，第二抗原结合部分包含抗4-1bb抗体，该抗体包含两条抗体重链和两条抗体轻链。在某些实施例中，第一抗原结合部分包含一个或多个抗gpc3抗体。在某些实施例中，第一抗原结合部分包含两个抗gpc3抗体。在某些实施例中，两条抗4-1bb轻链中的至少一条的c末端与第一抗原结合部分的抗gpc3抗体连接。在某些实施例中，两条抗4-1bb轻链中的每条的c末端与第一抗原结合部分的抗gpc3抗体连接。在某些实施例中，两条抗4-1bb轻链中的至少一条的n末端与第一抗原结合部分的抗gpc3抗体连接。在某些实施例中，两条抗4-1bb轻链中的每条的n末端与第一抗原结合部分的抗gpc3抗体连接。在某些实施例中，两条抗4-1bb重链中的至少一条的c末端与第一抗原结合部分的抗gpc3抗体连接。在某些实施例中，两条抗4-1bb重链中的每条的c末端与第一抗原结合部分的抗gpc3抗体连接。在某些实施例中，两条抗4-1bb重链中的至少一条的n末端与第一抗原结合部分的抗gpc3抗体连接。在某些实施例中，两条抗4-1bb重链中的每条的n末端与第一抗原结合部分的抗gpc3抗体连接。

7、在某些实施例中，第一抗原结合部分通过接头与第二抗原结合部分连接。在某些实施例中，接头是肽接头。在某些实施例中，肽接头包含约4至约30个氨基酸。在某些实施例中，肽接头包含选自由seq id no:16-50组成的组的氨基酸序列。

8、在某些实施例中，第二抗原结合部分的抗4-1bb抗体包含选自下组的fc区，该组由以下组成：igg、iga、igd、ige和igm的fc区。在某些实施例中，第二抗原结合部分的抗4-1bb抗体包含选自下组的fc区，该组由以下组成：igg1、igg2、igg3和igg4的fc区。在某些实施例中，fc区包含人fc区。在某些实施例中，fc区包含igg1 fc区。在某些实施例中，igg1 fc区包含s267e和l328f的突变。在某些实施例中，fc区包含igg4 fc区。在某些实施例中，igg4 fc区包含s228p突变。在某些实施例中，多特异性抗体是双特异性抗体。

9、在某些实施例中，该多特异性抗体包含：i)第一抗原结合部分，其包含单结构域抗gpc3抗体，该抗体包含含有seq id no:5中所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、包含seq idno:6中所示氨基酸序列的重链可变区cdr2、和包含seq id no:7中所示氨基酸序列的重链可变区cdr3；和ii)第二抗原结合部分，其包含抗4-1bb抗体，该抗体包含：重链可变结构域(vh)序列，其包含(1)包含seq id no:51中所示氨基酸序列的cdr-h1，(2)包含seq id no:52中所示氨基酸序列的cdr-h2，和(3)包含seq id no:53中所示氨基酸序列的cdr-h3；和轻链可变结构域(vl)序列，其包含：(1)包含seq id no:54中所示氨基酸序列的cdr-l1，(2)包含seq id no:55中所示氨基酸序列的cdr-l2，和(3)包含seq id no:56中所示氨基酸序列的cdr-l3。在某些实施例中，该多特异性抗体包含：i)第一抗原结合部分，其包含单结构域抗gpc3抗体，该抗体包含含有seq id no:5中所示氨基酸序列的重链可变区cdr1、包含seqid no:6中所示氨基酸序列的重链可变区cdr2、和包含seq id no:7中所示氨基酸序列的重链可变区cdr3；和ii)第二抗原结合部分，其包含抗4-1bb抗体，该抗体包含：重链可变结构域(vh)序列，其包含(1)包含seq id no:61中所示氨基酸序列的cdr-h1，(2)包含seq idno:62中所示氨基酸序列的cdr-h2，和(3)包含seq id no:63中所示氨基酸序列的cdr-h3；和轻链可变结构域(vl)序列，其包含：(1)包含seq id no:64中所示氨基酸序列的cdr-l1，(2)包含seq id no:65中所示氨基酸序列的cdr-l2，和(3)包含seq id no:66中所示氨基酸序列的cdr-l3。

10、在某些实施例中，该多特异性抗体包含含有seq id no:81中所示氨基酸序列的与抗gpc3抗体连接的抗4-1bb抗体重链和包含seq id no:85中所示氨基酸序列的抗4-1bb抗体轻链。在某些实施例中，多特异性抗体包含含有seq id no:82中所示氨基酸序列的与抗gpc3抗体连接的抗4-1bb抗体重链和包含seq id no:85中所示氨基酸序列的抗4-1bb抗体轻链。在某些实施例中，多特异性抗体包含含有seq id no:83中所示氨基酸序列的与抗gpc3抗体连接的抗4-1bb抗体重链和包含seq id no:85中所示氨基酸序列的抗4-1bb抗体轻链。在某些实施例中，多特异性抗体包含含有seq id no:84中所示氨基酸序列的与抗gpc3抗体连接的抗4-1bb抗体重链和包含seq id no:85中所示氨基酸序列的抗4-1bb抗体轻链。

11、本披露提供了包含与治疗剂连接的本文披露的任何多特异性抗体的免疫缀合物。在某些实施例中，治疗剂是细胞毒素或放射性同位素。

12、本披露提供了一种药物组合物，其包含a)本文披露的任何多特异性抗体、本文披露的任何免疫缀合物或本文披露的任何免疫应答细胞，以及b)药学上可接受的载剂。

13、本披露还提供了编码本文披露的任何多特异性抗体的核酸、包含本文披露的任何核酸的载体以及包含本文披露的任何核酸或载体的宿主细胞。

14、本披露提供了一种制备本文披露的多特异性抗体的方法，该方法包括在本文披露的宿主细胞中表达多特异性抗体并从宿主细胞中分离该多特异性抗体。

15、本披露还提供了一种减轻受试者肿瘤负荷的方法。在某些实施例中，该方法包括向受试者施用有效量的本文披露的多特异性抗体、本文披露的免疫缀合物或本文披露的药物组合物。在某些实施例中，该方法减少肿瘤细胞的数量。在某些实施例中，该方法减小肿瘤大小。在某些实施例中，该方法根除受试者的肿瘤。在某些实施例中，肿瘤表现出高微卫星不稳定性(msi)。在某些实施例中，肿瘤选自下组，该组由以下组成：间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及其组合。

16、本披露提供了治疗和/或预防癌症或延长癌症受试者存活期的方法。在某些实施例中，该方法包括向受试者施用有效量的本文披露的多特异性抗体、本文披露的免疫缀合物或本文披露的药物组合物。在某些实施例中，癌症表现出高微卫星不稳定性(msi)。在某些实施例中，癌症选自下组，该组由以下组成：间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及其组合。

17、本披露还提供了本文披露的用作药物的任何多特异性抗体和/或药物组合物。本披露还提供了本文披露的用于治疗癌症的任何多特异性抗体和/或药物组合物。在某些实施例中，癌症表现出高微卫星不稳定性(msi)。在某些实施例中，癌症选自下组，该组由以下组成：间皮瘤、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、胸膜肿瘤、成胶质细胞瘤、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤、胸腺癌、子宫内膜癌、胃肿瘤、胆管癌、头颈癌、血液癌及其组合。

18、本披露提供了一种试剂盒，其包含本文披露的多特异性抗体、本文披露的免疫缀合物、本文披露的药物组合物、本文披露的核酸、本文披露的载体或本文披露的免疫应答细胞。在某些实施例中，试剂盒还包含用于治疗和/或预防赘生物的书面说明书。