防御反应增强、病害程度降低的植物及其生成方法与流程

本发明涉及农业领域。更具体地说，本发明涉及通过crispr/cas系统进行基因编辑来增加植物抗性和减少病原体感染造成的损害。

背景技术：

1、在露地和温室栽培系统中，植物病原体是许多作物最重要的产量限制因素(见vitti a，sofo a，scopa a，nuzzaci m.2015)，预计这一趋势还会增加。真菌和细菌病原体是全球番茄作物遭受重大损失的原因，它们会产生毁灭性病害。杀虫剂策略可能缺乏效果，而且往往是污染和损害消费者健康的根源，许多杀虫剂在全球范围内越来越多地被禁用。诱导抗性被认为是在营养组织中实现生物控制的一种重要作用模式(见kuc，1987年；sequeira，1983年)。由各种微生物引起的诱导系统抗性(isr)可保护植物免受土壤或叶面病原体的侵害(见paulitz和matta，2000年)。在农业中，对抗植物病害的最环保方法是利用植物的先天免疫系统，例如通过将作物植物或其近亲的自然种群中发生的多态抗性基因杂交到作物品种中。然而，植物病原体与寄主植物共同进化，并开发了克服免疫系统的方法。(参见houterman pm等人，2008年真菌效应因子对植物抗病基因免疫的抑制。plos pathog4(5)：e1000061)。

2、有鉴于此，长期以来一直需要开发新的方法，通过解除免疫抑制来提高作物的免疫力。

3、木霉真菌蛋白诱导子eix(乙烯诱导木聚糖酶)可诱导特定植物物种和/或品种的乙烯生物合成、电解质渗漏、pr蛋白表达和超敏反应(hr)(见bailey等人，1990年，1992年；ron等人，2000年；elbaz等人，2002年)。eix被表明能与番茄和烟草有反应的栽培品种的质膜特异性结合(见hanania和avni，1997年)。烟草和番茄栽培品种对eix的反应是由单个显性基因座控制的，称为leeix(见ron和avni，2004年)。leeix基因座包含两个受体，即leeix1和leeix2，两者都属于富亮氨酸重复细胞表面糖蛋白。两种受体都能与eix诱导子结合，但只有leeix2受体能介导植物防御反应(见kuc j.1987)。leeix1充当诱饵受体，减弱eix诱导的leeix2受体信号传导(见sequeira l.1983年，paulitz,t.c.,matta,a.2000年)。

4、考虑到eix通过与leeix2的结合和下游信号传导提高植物免疫力(见kucj.1987)，而leeix1能够阻断这种促进免疫力的下游信号传导(见sequeira l.1983、paulitz,t.c.、matta,a.2000)，本发明的发明人假设移除/突变leeix1可能会导致更强的免疫激活和抗病性的提高。

5、鉴于现有技术，并鉴于上述各种挑战，开发用于增强植物防御反应和病原体抗性的新型方法的需求仍未得到满足。

技术实现思路

1、因此，本发明的目的是公开一种突变植物系，其特征在于，与相同种群的非突变植物相比具有增强的防御反应，其中所述突变植物携带受损的leeix1(番茄乙烯诱导木聚糖酶受体1)基因。

2、本发明的另一个目的是公开一种突变植物系，其特征在于，与相同种群的非突变植物相比，在病原体暴露时病害程度降低，其中所述突变植物携带受损的leeix1(番茄乙烯木聚糖酶受体1)基因。

3、本发明的另一个目的是公开上述突变植物系，其中所述突变植物系与受损的leeix1基因是纯合的。

4、本发明的另一个目的是公开上述的突变植物系，其中所述突变植物系表达非功能性、截短的leeix1蛋白。

5、本发明的另一个目的是公开上述的突变植物系，其中所述植物是茄科的成员。

6、本发明的另一个目的是公开上述的突变植物系，其中所述植物选自：蕃茄(solanum lycopersicum)、烟草(nicotiana tabacum)、马铃薯(solanum tuberosum)、茄子(solanum melongena)、辣椒(capsicum annum)、矮牵牛(petunia hybrida)、leeix1基因表达的植物、表达leeix1功能直系同源物的植物，以及它们的任意组合。

7、本发明的另一个目的是公开上述的突变植物系，其中所述增强的防御反应在与病原体或生物控制剂(bca)相互作用时会进一步增强。

8、本发明的另一个目的是公开上述的突变植物系，其中通过生物控制剂(bca)进一步提高了病害程度的降低。

9、本发明的另一个目的是公开上述病原体，其中所述病原体选自：病毒，细菌，真菌，卵菌，害虫，及其任意组合。

10、本发明的另一个目的是公开上述病原体，其中所述病原体选自：葡萄孢属(botrytis)，核盘菌属(sclerotinia)，齐整小核菌(sclerotium rolfsii)，链格孢属(alternaria)，腐霉菌属(pythium)，疫霉属(phytopthora)，镰刀菌属(fusarium)，粉孢属(oidium)，色二孢属(lasodiplodia)，青霉属(penicillium)，曲霉属(aspergillus)，篮状菌属(talaromyces)，壳球孢属(macrophomina)，轮枝孢属(verticillium)，枝孢属(cladosporium)，棒形杆菌(clavibacter)，假单胞菌属(pseudomonas)，黄单胞菌属(xanthomonas)，木质部小菌属(xyllela)，欧文氏菌属(erwinia)，烟草花叶病毒(tobamoviruses)，番茄黄化卷叶病毒病，双生病毒，蝇，螨，叶蝉，潜叶虫。

11、本发明的另一个目的是公开上述生物控制剂，其中所述控制剂选自以下：

12、a.昆虫；

13、b.微生物，如真菌，细菌，卵菌，病毒；

14、c.化学物质，如核酸，激素，激素类似物，天然产物，有机化合物。

15、本发明的另一个目的是公开上述生物控制剂，其中所述控制剂为哈茨木霉菌。

16、本发明的另一个目的是公开上述生物控制剂，其中所述控制剂为t39。

17、本发明的另一个目的是公开上述突变植物系，其中所述突变植物系借助于基因编辑系统进行突变。

18、本发明的另一个目的是公开上述突变植物系，其中所述基因编辑系统选自：基因编辑剂，巨核酸酶，锌指核酸酶，talen，crispr/cas，及其任意组合。

19、本发明的另一个目的是公开上述突变植物系，其中所述基因编辑系统为crispr/cas 9系统。

20、本发明的另一个目的是公开一种增强植物防御反应的方法，包括以下步骤：

21、a.设计至少一种核酸序列，其配置为靶向和损伤leeix1基因，

22、b.利用所述至少一种核酸序列进行基因编辑处理，以及

23、c.获得至少一个突变植物系，携带有受损leeix1基因。

24、本发明的另一个目的是公开一种增强植物防御反应的方法，包括以下步骤：

25、a.设计至少一种核酸序列，配置为靶向和损伤植物的leeix1基因，

26、b.利用所述至少一种核酸序列进行基因编辑处理，

27、c.获得至少一个突变植物系，携带有受损leeix1基因，

28、d.培育所述植物，

29、e.给所述植物接种至少一种细菌生物控制剂。

30、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述核酸序列选自：dna，rna，trna，grna，cdna，杂交核酸，或它们的任意组合。

31、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述核酸序列是crispr/cas9基因编辑系统的grna。

32、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述植物为茄科的成员。

33、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述植物选自：蕃茄，烟草，马铃薯，茄子，辣椒，矮牵牛，leeix1基因表达的植物，表达leeix1直系同源物的植物，以及它们的任意组合。

34、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述突变植物系与受损的leeix1基因是纯合的。

35、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述突变植物系表达非功能性、截短的leeix1蛋白。

36、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述突变植物系具有至少一种增强的防御反应。

37、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述增强的防御反应在与病原体或生物控制剂(bca)相互作用时会进一步增强。

38、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述病原体选自：病毒，细菌，真菌，卵菌，害虫，及其任意组合。

39、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述病原体选自：葡萄孢属，核盘菌属，齐整小核菌，链格孢属，腐霉菌属，疫霉属，镰刀菌属，粉孢属，色二孢属，青霉属，曲霉属，篮状菌属，壳球孢属，轮枝孢属，枝孢属，棒形杆菌、假单胞菌属、黄单胞菌属，木质部小菌属，欧文氏菌属，烟草花叶病毒，番茄黄化卷叶病毒病，双生病毒，蝇，螨，叶蝉，潜叶虫，及其任意组合。

40、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述至少一种生物控制剂选自以下：

41、a.昆虫，

42、b.微生物，如真菌，细菌，卵菌，病毒，

43、c.化学物质，如核酸，激素，激素类似物，天然产物，有机化合物。

44、本发明的另一个目的是公开上述的真菌，其中所述真菌为木霉菌属。

45、本发明的另一个目的是公开上述细菌，其中所述细菌选自芽孢杆菌属、假单胞菌属。

46、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述至少一种生物控制剂是哈茨木霉菌。

47、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述至少一种生物控制剂是t39。

48、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述生物控制剂选自以下：

49、a.昆虫，

50、b.微生物，如真菌，细菌，卵菌，病毒，

51、c.化学物质，如核酸，激素，激素类似物，天然产物，有机化合物。

52、本发明的另一个目的是公开上述的真菌，其中所述真菌为木霉菌属。

53、本发明的另一个目的是公开上述细菌，其中所述细菌选自芽孢杆菌属、假单胞菌属。

54、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述生物控制剂是哈茨木霉菌。

55、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述生物控制剂是t39。

56、本发明的另一个目的是公开一种降低植物病害程度的方法，包括以下步骤：

57、a.设计至少一种核酸序列，配置为靶向和损伤leeix1基因，

58、b.利用所述至少一种核酸序列进行基因编辑处理，以及

59、c.获得至少一个携带受损leeix1基因的突变植物系。

60、本发明的另一个目的是公开一种降低植物病害程度的方法，包括以下步骤：

61、a.设计至少一种核酸序列，配置为靶向和损伤植物的leeix1基因，

62、b.利用所述至少一种核酸序列进行基因编辑处理，

63、c.获得至少一个携带受损leeix1基因的突变植物系、

64、d.培育所述植物，

65、e.给所述植物接种至少一种细菌生物控制剂。

66、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述核酸序列选自：dna，rna，trna，grna，cdna，杂交核酸，或其任意组合。

67、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述核酸序列是crispr/cas9基因编辑系统的grna。

68、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述植物为茄科的成员。

69、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述植物选自：蕃茄，烟草，马铃薯，茄子，辣椒，矮牵牛，leeix1基因表达的植物，表达leeix1直系同源物的植物，以及它们的任意组合。

70、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述突变植物系与受损的leeix1基因是纯合的。

71、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述突变植物系表达非功能性、截短的leeix1蛋白。

72、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述突变植物系在暴露于至少一种病原体时病害程度降低。

73、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中在与生物控制剂(bca)相互作用时，所述病害程度的降低程度会进一步提高。

74、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述至少一种生物控制剂选自以下：

75、a.昆虫，

76、b.微生物，如真菌，细菌，卵菌，病毒，

77、c.化学物质，如核酸，激素，激素类似物，天然产物，有机化合物。

78、本发明的另一个目的是公开上述的真菌，其中所述真菌为木霉菌属。

79、本发明的另一个目的是公开上述细菌，其中所述细菌选自芽孢杆菌属、假单胞菌属。

80、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述至少一种生物控制剂是哈茨木霉菌。

81、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述至少一种生物控制剂是t39。

82、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述生物控制剂选自以下：

83、a.昆虫，

84、b.微生物，如真菌，细菌，卵菌，病毒，

85、c.化学物质，如核酸，激素，激素类似物，天然产物，有机化合物。

86、本发明的另一个目的是公开上述的真菌，其中所述真菌为木霉菌属。

87、本发明的另一个目的是公开上述细菌，其中所述细菌选自芽孢杆菌属、假单胞菌属。

88、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述生物控制剂是哈茨木霉菌。

89、本发明的另一个目的是公开上述方法，其中所述生物控制剂是t39。

90、附图说明