用于生产脂肪酸酯的脂肪酶

本发明涉及脂肪酶及其用途。

背景技术：

1、脂肪酶是一类在脂质代谢中能够催化三酰基甘油水解成游离脂肪酸的酶。在存在短链醇时，一些酶可以催化植物油的酯交换反应，将其转化为生物柴油。最近，生物柴油作为化石燃料的绿色替代物，受到了广泛关注。在工业规模上高效生产生物柴油受到酶的可重复使用性及其对高浓度有机溶剂的耐受性的限制。

2、生物柴油是衍生自由长链脂肪酸烷基酯(faae)组成(例如脂肪酸甲酯(fame))的有机材料的生物燃料的一种形式。近年来，生物柴油因其可再生性和对环境的影响最小而被用作化石燃料的绿色替代物。据估计，随着全球对能源的需求不断增加，到2050年，通过绿色制造产生清洁、可再生能源将很快成为大多数国家的重要能源。这将涉及通过整合自动化和其他环保和更节能的技术来重设计和重组我们当前的制造过程。

3、目前世界上大部分的生物柴油供应来自利用碱催化植物油和酒精酯交换的化学过程。然而，该过程会产生大量富碱废水，对环境造成进一步负担。利用脂肪酶进行的酶介导的faae生产提供了化学方法的良好替代，因为这些酶能够耐受通常与碱水解不相容的各种原料(例如非食用油和废油)。然而，与使用脂肪酶生产生物柴油相关的主要缺点是这些酶对有机溶剂的耐受性低。尽管高通量筛选和蛋白质工程已被广泛用于鉴别具有更高热稳定性和甲醇耐受性的脂肪酶，但酶介导的生物柴油生产成本仍然很高

4、迄今为止，脂肪酶的大多数高通量筛选都是通过宏基因组文库的功能筛选进行的，以鉴别具有适合工业应用特性的酶。然而，此类文库的构建通常很繁琐，并且对原生宿主的密码子使用有很强的偏好。当将不同的宿主用于筛选时，这可能会导致分离出不同克隆。

5、本说明书中列出或讨论已发表文献并不一定表示承认该文献是现有技术的一部分或已成为公知常识。

6、本文提及的任何文献均以引用其全文的方式纳入本文。

技术实现思路

1、在本发明的第一方面，提供了一种生产脂肪酸酯的方法，该方法包括：(a)提供包含三酰基甘油酯和/或脂肪酸，短链醇和酶的混合物，所述酶包含选自seq id no:(序列识别号)1至6和8至114中任一项的序列；和(b)在足以形成脂肪酸酯的条件下将混合物孵育一段时间。优选地，酶基本由所述序列组成或由所述序列组成。

2、所称“醇”，它包括含有一个或多个羟基的烃化合物，并且包括醇类(诸如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丙醇、异丁醇、叔丁醇、戊醇、环戊醇、异戊醇、新戊醇、己醇、异己醇、环己醇、3-甲基戊醇、2,2-二甲基丁醇、2,3-二甲基丁醇及其异构体)。在各种实施方式中，所述醇选自以下组：甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇。优选地，所述醇为甲醇或乙醇，更优选甲醇。

3、在各种实施方式中，醇以10％v/v至70％v/v存在。在各种实施方式中，醇可以至少20％v/v，优选至少30％v/v，更优选至少40％v/v，甚至更优选至少50％v/v存在。在实施方式中，醇可以约40％v/v存在。

4、在一些实施方式中，酶选自以下组：seq id no:90、seq id no:5、seq id no:22、seq id no:27、seq id no:35、seq id no:53、seq id no:54、seq id no:55、seq id no:57、seq id no:60、seq id no:62、seq id no:64、seq id no:68、seq id no:70、seq idno:73、seq id no:74、seq id no:87、seq id no:89、seq id no:91、seq id no:92、seq idno:93、seq id no:95、seq id no:96、seq id no:100、seq id no:107、seq id no:108和seq id no:109。优选地，脂肪酶包含seq id no:90。

5、在各种实施方式中，三酰基甘油酯存在于所述混合物中，并且三酰基甘油酯是长链三酰基甘油酯。优选地，三酰基甘油酯是三油酸甘油酯。优选地，酶选自以下组：seq idno:90、seq id no:53、seq id no:27、seq id no:55、seq id no:60、seq id no:73和seqid no:107。

6、在各种实施方式中，脂肪酸存在于所述混合物中，并且脂肪酸是长链脂肪酸。脂肪酸可以是油酸。优选地，酶选自下组中：seq id no:90、seq id no:57、seq id no:74、seqid no:seq id no:92、seq id no:93和seq id no:108。

7、在各种实施方式中，其中三酰基甘油酯和/或脂肪酸是棕榈油脂肪酸馏出物。

8、优选地，脂肪酸酯的产率为至少80％。优选地脂肪酸酯的产率为至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％。

9、在本发明的第二方面，提供一种水解酯的方法，该方法包括提供包含三酰基甘油酯、水和酶的混合物，该酶包含选自下组的序列：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:4、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:30、seq id no:31、seq id no:33、seq id no:35、seq idno:36、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:43、seq idno:44、seq id no:45、seq id no:46、seq id no:54、seq id no:55、seq id no:56、seq idno:59、seq id no:60、seq id no:61、seq id no:62、seq id no:64、seq id no:66、seq idno:67、seq id no:68、seq id no:70、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq idno:76、seq id no:77、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:82、seq id no:83、seq idno:85、seq id no:86、seq id no:88、seq id no:91、seq id no:97、seq id no:98、seq idno:100、seq id no:101、seq id no:103、seq id no:104、seq id no:105、seq id no:106、seq id no:107、seq id no:108、seq id no:109、seq id no:110和seq id no:113。

10、在本发明的第三方面，提供通过第一和第二方面的方法获得的产品。

11、在本发明的第四方面，提供一种分离的脂肪酶，其包含选自seq id no.1至114中任一项的序列。优选地，分离的脂肪酶基本包含所述序列，基本由所述序列组成或由所述序列组成。优选地，脂肪酶经纯化。优选地，序列选自以下组：seq id no:90、seq id no:1、seqid no:2、seq id no:5、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seqid no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:30、seq id no:31、seq id no:35、seqid no:36、seq id no:38、seq id no:39、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:43、seqid no:44、seq id no:45、seq id no:46、seq id no:53、seq id no:54、seq id no:55、seqid no:56、seq id no:57、seq id no:59、seq id no:60、seq idno:61、seq id no:62、seqid no:64、seq id no:66、seq id no:67、seq id no:68、seq id no:70、seq id no:72、seqid no:73、seq id no:74、seq id no:77、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:82、seqid no:83、seq id no:85、seq id no:86、seq id no:87、seq id no:88、seq id no:89、seqid no:91、seq id no:92、seq id no:93、seq id no:95、seq id no:96、seq id no:97、seqid no:98、seq id no:100、seq id no:101、seq id no:103、seq id no:105、seq id no:107、seq id no:108、seq id no:109、seq id no:110和seq id no:113。

12、优选地，序列选自以下组：seq id no:30、seq id no:39、seq id no:40、seq idno:46、seq id no:85和seq id no:113。有利的是，这些序列在酸性介质中具有活性。

13、优选地，序列选自以下组：seq id no:54、seq id no:98、seq id no:107、seq idno:1、seq id no:2、seq id no:25、seq id no:59、seq id no:68、seq id no:73、seq idno:83、seq id no:86、seq id no:97和seq id no:101。有利的是，这些序列在碱性介质中具有活性。

14、优选地，序列选自以下组：seq id no:96、seq id no:70、seq id no:5、seq idno:35、seq id no:22、seq id no:30、seq id no:43、seq id no:44、seq id no:53、seq idno:57、seq id no:64、seq id no:66、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:87、seq idno:89、seq id no:90、seq id no:91、seq id no:92、seq id no:93、seq id no:95、seq idno:97、seq id no:105和seq id no:108。有利的是，这些序列的热变性温度(meltingtemperature)为至少60℃。

15、优选地，脂肪酶包含seq id no:90。

16、在第五方面，本发明提供了根据本发明的第四方面编码脂肪酶的多核苷酸。因此，本发明还提供一种包含多核苷酸的载体，以及包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞。

17、在查看以下附图和描述之后，其他技术优点对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。