受保护的效应细胞及其用于同种异体过继性细胞疗法的用途的制作方法

本公开与现成的免疫细胞产物领域广泛地相关。更具体地说，本公开与研发能够体内递送治疗相关特性的多功能效应细胞的策略相关。根据本公开研发的细胞产物解决了患者来源的细胞疗法的关键限制。

背景技术：

1、过继性细胞疗法领域目前的重点是使用患者来源的细胞和供体来源的细胞，这使得实现癌症免疫疗法的持续制造以及向所有可能从中受益的患者递送疗法尤其困难。还需要改善过继转移的淋巴细胞的功效和存留，以促进良好的患者结果。淋巴细胞(如t细胞和自然杀伤(nk)细胞)是有效的抗肿瘤效应子，其在先天性和适应性免疫中起重要作用。然而，将这些免疫细胞用于过继性细胞疗法仍然有挑战性，并且尚未满足改善的需求。因此，在过继性免疫疗法中，仍有大量机会来利用t细胞和nk细胞或其他淋巴细胞的全部潜能。

技术实现思路

1、需要功能上改善的效应细胞，以在以下范围内解决问题：从反应速率、细胞耗竭、输血细胞损失(存活和/或存留)、肿瘤经由标靶损失或谱系转换逃逸、肿瘤靶向精确度、脱靶毒性、肿瘤外效应到针对实体肿瘤的功效，即肿瘤微环境和相关免疫抑制、募集、运输和浸润。

2、本发明的实施方案的目的是用以产生由单一细胞衍生ipsc(诱导性多能干细胞)克隆系分化的衍生非多能细胞的方法和组合物，该ipsc系包含在其基因组中的一种或几种基因修饰。在一些实施方案中，所述一种或几种基因修饰包括dna插入、缺失和取代，并且该修饰在分化、扩增、传代和/或移植后在随后衍生细胞中保留并且保持功能性。

3、本技术的ipsc衍生非多能细胞包括但不限于cd34+细胞、生血内皮细胞、hsc(造血干细胞和祖细胞)、造血多能祖细胞、t细胞祖细胞、nk细胞祖细胞、t细胞、nkt细胞、nk细胞和b细胞。本技术的ipsc衍生非多能细胞通过由包含相同基因修饰的ipsc分化在它们的基因组中包含一种或多种基因修饰。在一些实施方案中，用于获得基因工程改造的衍生细胞的工程改造的克隆ipsc分化策略受益于ipsc在定向分化中的发育潜能，该定向分化不会显著地受到ipsc中的工程改造模式的不利影响，并且也要求工程改造模式如预期那样在衍生细胞中起作用。此外，这一策略克服工程改造的原代淋巴细胞(例如由外周血获得的t细胞或nk细胞)的现有障碍，因此细胞难以工程改造，并且工程改造这类细胞通常缺乏再现性和均匀性，使得细胞展现伴随高细胞死亡和低细胞扩增的不良细胞存留。

4、因此，在一个方面，本发明提供了细胞或其群体，其中：(i)细胞是诱导多能细胞(ipsc)、克隆ipsc、ips细胞系细胞或从分化ipsc获得的衍生细胞；(ii)细胞包含(a)hla-i缺乏；(b)cd38敲除；以及任选地，(c)编码cd16或其变体的外源多核苷酸。在各种实施方案中，细胞或其群体还包含以下中的一者或多者：(i)编码细胞因子信号传导复合体的外源多核苷酸，该细胞因子信号传导复合体包含细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或全部肽；(ii)编码嵌合抗原受体(car)的外源多核苷酸；(iii)hla-ii缺乏；以及(iv)编码hla-g、hla-e或其变体的外源多核苷酸，其中细胞适合于cd38调节，其中细胞在并入cd38调节的过继性细胞疗法中在同种异体反应性宿主细胞的存在下具有改善的持久性。在各种实施方案中，细胞：(i)包含表1中列出的基因型中的至少一种基因型；(ii)包含cd58和cd54中的一者或两者的敲除；(iii)包含b2m、ciita、tap1、tap2、tap相关蛋白、nlrc5、rfxank、rfx5、rfxap、tcr、nkg2a、nkg2d、cd25、cd69、cd44、cd56、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3和tigit中的至少一者的破坏；(iv)包含4-1bbl、cd3、cd4、cd8、cd47、cd113、cd131、cd137、cd80、pdl1、a2ar、tcr、fc受体、抗体或其功能性变体或片段、检查点抑制剂、衔接子和用于与双特异性或多特异性或通用衔接子偶联的表面触发受体中的至少一者的引入；和/或(v)不包含编码hla-g、hla-e或其变体的外源多核苷酸。在一些实施方案中，hla-i缺乏包含以下中的至少一者的破坏：b2m、tap1、tap2和tap相关蛋白。在一些其他实施方案中，hla-ii缺乏包含以下中的至少一者的破坏：ciita、rfx5、rfxap和rfxank。

5、在细胞或其群体的各种实施方案中，衍生细胞：(a)包含衍生cd34+细胞、衍生造血干细胞和祖细胞、衍生造血多能祖细胞、衍生t细胞祖细胞、衍生nk细胞祖细胞、衍生t细胞、衍生nkt细胞、衍生nk细胞或衍生b细胞；或者(b)用作同种异体效应细胞，其中效应细胞是具有以下特性中的至少一种特性的衍生nk细胞或衍生t细胞，该特性包括：与由外周血、脐带血或任何其他供体组织获得的其原生对应细胞相比，(i)改善的存留和/或存活；(ii)对活化的受体免疫细胞的增加的抗性；(iii)增加的细胞毒性；(iv)改善的肿瘤渗透；(v)增强或获取的adcc；(vi)旁观者免疫细胞迁移到肿瘤部位和/或激活或募集到肿瘤部位的能力增强；(vii)降低肿瘤免疫抑制的能力增强；(viii)挽救肿瘤抗原逃逸的能力提高；以及(ix)减少的自相残杀。

6、在细胞或其群体的各种实施方案中，cd16或其变体包含以下中的至少一者：(a)高亲和力不可裂解的cd16(hncd16)或其变体；(b)cd16的胞外域中的f176v和s197p；(c)源自cd64的全部或部分胞外域；(d)非原生(或非cd16)跨膜结构域；(e)非原生(或非cd16)胞内结构域；(f)非原生(或非cd16)信号传导结构域；(g)非原生刺激结构域；以及(h)并非源自cd16并且源自相同或不同多肽的跨膜结构域、信号传导结构域和刺激结构域。在某些实施方案中，(a)非原生跨膜结构域衍生自cd3δ、cd3ε、cd3γ、cd3ζ、cd4、cd8、cd8a、cd8b、cd27、cd28、cd40、cd84、cd166、4-1bb、ox40、icos、icam-1、ctla-4、pd-1、lag-3、2b4、btla、cd16、il7、il12、il15、kir2dl4、kir2ds1、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2c、nkg2d或t细胞受体(tcr)多肽；(b)非原生刺激结构域衍生自cd27、cd28、4-1bb、ox40、icos、pd-1、lag-3、2b4、btla、dap10、dap12、ctla-4或nkg2d多肽；(c)非原生信号传导结构域衍生自cd3ζ、2b4、dap10、dap12、dnam1、cd137(4-1bb)、il21、il7、il12、il15、nkp30、nkp44、nkp46、nkg2c或nkg2d多肽；或者(d)非原生跨膜域衍生自nkg2d，非原生刺激域衍生自2b4，并且非原生信号传导域衍生自cd3ζ。

7、在细胞或其群体的各种实施方案中，car是：(i)t细胞特异性或nk细胞特异性；(ii)双特异性抗原结合car；(iii)可切换的car；(iv)二聚化car；(v)分离car；(vi)多链car；(vii)诱导性car；(viii)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中，与包含细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或完整肽的细胞因子信号传导复合体共表达；(ix)任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中，与检查点抑制剂共表达；和/或(x)任选地在trac或trbc基因座处插入，和/或由tcr的内源启动子驱动，和/或tcr由car插入而敲除；安全港基因座；或旨在用于破坏的基因座。在细胞或其群体的各种实施方案中，car：(i)对cd19、bcma、b7h3、mica/b或mr1具有特异性；和/或(ii)对以下中的任一者具有特异性：adgre2、碳酸酐酶ix(caix)、ccr1、ccr4、癌胚抗原(cea)、cd3、cd5、cd7、cd8、cd10、cd20、cd22、cd30、cd33、cd34、cd38、cd41、cd44、cd44v6、cd49f、cd56、cd70、cd74、cd99、cd123、cd133、cd138、cds、clec12a、巨细胞病毒(cmv)感染的细胞的抗原、上皮糖蛋白2(egp-2)、上皮糖蛋白-40(egp-40)、上皮细胞粘附分子(epcam)、egfrviii、受体酪氨酸-蛋白激酶erb-b2,3,4、egfir、egfr-viii、erbb叶酸结合蛋白(fbp)、胎儿型乙酰胆碱受体(achr)、叶酸受体α、神经节苷脂g2(gd2)、神经节苷脂g3(gd3)、人类表皮生长因子受体2(her2)、人类端粒酶逆转录酶(htert)、icam-1、整合素b7、白细胞介素-13受体亚基α-2(il-13rα2)、κ-轻链、激酶插入域受体(kdr)、路易斯a(ca19.9)、路易斯y(ley)、l1细胞粘附分子(l1-cam)、lilrb2、黑色素瘤抗原家族a1(mage-a1)、粘蛋白1(muc-1)、粘蛋白16(muc-16)、间皮素(msln)、nkcsi、nkg2d配体、c-met、癌症-睾丸抗原ny-eso-1、癌胚抗原(h5t4)、prame、前列腺干细胞抗原(psca)、prame前列腺特异性膜抗原(psma)、肿瘤相关糖蛋白72(tag-72)、tim-3、trbc1、trbc2、血管内皮生长因子r2(vegf-r2)、威尔姆斯肿瘤蛋白质(wt-1)和病原体抗原。

8、在细胞或其群体的各种实施方案中，细胞因子信号传导复合体包含：(a)细胞表面表达的外源细胞因子和/或其受体的部分或全部肽，包含il2、il4、il6、il7、il9、il10、il11、il12、il15、il18、il21或其相应受体中的至少一者。或(b)以下中的至少一者：(i)在其间具有自裂解肽的il15和il15rα的共表达；(ii)il15和il15rα的融合蛋白；(iii)il15rα的胞内结构域截短的il15/il15rα融合蛋白(il15δ)；(iv)il15和il15rα的膜结合的寿司结构域的融合蛋白；(v)il15和il15rβ的融合蛋白；(vi)il15和共同受体γc的融合蛋白，其中所述共同受体γc是原生的或经过修饰的；以及(vii)il15rβ的同源二聚体；其中(i)-(vii)中的任一者任选地在单独构建体中或在双顺反子构建体中与car共表达；以及任选地，(c)瞬时表达。

9、在细胞或其群体的各种实施方案中，细胞是衍生nk细胞或衍生t细胞，其中衍生nk细胞能够将t细胞募集和/或迁移到肿瘤部位，并且其中衍生nk细胞或衍生t细胞能够在一种或多种检查点抑制剂存在下降低肿瘤免疫抑制。在一些实施方案中，一种或多种检查点抑制剂是针对一种或多种检查点分子的拮抗剂，该检查点分子包含pd-1、pdl-1、tim-3、tigit、lag-3、ctla-4、2b4、4-1bb、4-1bbl、a2ar、bate、btla、cd39、cd47、cd73、cd94、cd96、cd160、cd200、cd200r、cd274、ceacam1、csf-1r、foxpl、garp、hvem、ido、edo、tdo、lair-1、mica/b、nr4a2、mafb、oct-2、rara(视黄酸受体α)、tlr3、vista、nkg2a/hla-e或抑制性kir。在特定实施方案中，一种或多种检查点抑制剂包含：(a)阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、iph4102、iph43、iph33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和它们的衍生物或功能等效物中的一者或多者；或(b)阿特珠单抗、纳武单抗和帕博利珠单抗中的至少一者。

10、在细胞或其群体的各种实施方案中，该细胞包含：(i)整合在安全港基因座或旨在用于破坏的基因座中的一个或多个外源多核苷酸；或(ii)整合在不同安全港基因座或旨在用于破坏的基因座中的超过两个外源多核苷酸。在一些实施方案中，一个或多个安全港基因座包含aavs1、ccr5、rosa26、胶原蛋白、htrp、h11、gapdh、tcr或runx1中的至少一者；或者其中一个或多个旨在用于破坏的基因座包含b2m、tap1、tap2、tap相关蛋白、nlrc5、ciita、rfxank、rfx5、rfxap、tcrα或β恒定区、nkg2a、nkg2d、cd38、cd25、cd69、cd71、cd44、cd58、cd54、cd56、cis、cbl-b、socs2、pd1、ctla4、lag3、tim3或tigit。

11、在细胞或其群体的各种实施方案中，cd38调节：(i)通过包含抗cd38抗体或与cd38特异性结合的car(cd38-car)的cd38拮抗剂；(ii)通过达雷木单抗、伊沙妥昔单抗或mor202；(iii)通过达雷木单抗；(iv)包括在用于过继性细胞疗法的细胞或其群体的输注之前、期间或之后，将cd38拮抗剂施用于需要该疗法的受试者；(v)包括在输注预负载的细胞或其群体之前将cd38拮抗剂体外预负载到细胞或其群体；(vi)消除或减少同种异体反应性宿主细胞的数量；(vii)延迟宿主免疫重构和/或(viii)在需要过继性细胞疗法的受试者的同种异体反应性宿主细胞的存在下延长细胞或其群体的存活和存留。在细胞或其群体的各种实施方案中，同种异体反应性宿主细胞：(i)包含与细胞或其群体同种异体的原代t细胞、b细胞和/或nk细胞；(ii)对细胞或其群体的cd38调节敏感；和/或(iii)经由cd38拮抗剂以剂量依赖性方式通过cd38调节而消除。

12、在另一个方面，本发明提供了一种组合物，该组合物包含cd38拮抗剂和本文所述的细胞或其群体。在各种实施方案中，组合物还包含一种或多种治疗剂。在特定实施方案中，一种或多种治疗剂包含肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、小rna、dsrna(双链rna)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包含一种或多种所关注多核酸的载体、抗体、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(imid)。在一些实施方案中，(i)检查点抑制剂包含：(a)检查点分子的一种或多种拮抗剂，该检查点分子包括pd-1、pdl-1、tim-3、tigit、lag-3、ctla-4、2b4、4-1bb、4-1bbl、a2ar、bate、btla、cd39、cd47、cd73、cd94、cd96、cd160、cd200、cd200r、cd274、ceacam1、csf-1r、foxp1、garp、hvem、ido、edo、tdo、lair-1、mica/b、nr4a2、mafb、oct-2、rara(视黄酸受体α)、tlr3、vista、nkg2a/hla-e或抑制性kir；(b)阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、iph4102、iph43、iph33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和它们的衍生物或功能等效物中的一者或多者；(c)阿特珠单抗、纳武单抗和帕博利珠单抗中的至少一者；或者(ii)该治疗剂包含维奈妥拉、阿扎胞苷和泊马度胺中的一者或多者。在一些实施方案中，抗体包含：(a)抗cd20抗体、抗her2抗体、抗cd52抗体、抗egfr抗体、抗cd123抗体、抗gd2抗体、抗pdl1抗体、抗cd25抗体、抗cd69抗体、抗cd71抗体或抗cd44抗体；或(b)利妥昔单抗、维妥珠单抗、奥法木单抗、乌妥昔单抗、奥卡妥珠单抗、奥妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、阿伦单抗、西妥昔单抗、迪妥昔单抗、阿维鲁单抗、达克利珠单抗、巴利昔单抗、m-a251、2a3、bc69、24204、22722、24212、mab23591、fn50、298614、af2359、cy1g4、df1513、比伐珠单抗、rg7356、g44-26、7g3、csl362、依托珠单抗和它们的人源化或经过fc修饰的变体或片段和它们的功能等效物及其生物类似物中的一者或多者。

13、在组合物的各种实施方案中，cd38拮抗剂：(i)包含抗cd38抗体或cd38-car；(ii)包含达雷木单抗、伊沙妥昔单抗或mor202；(iii)包含达雷木单抗；或(iv)在细胞或其群体的输注之前、期间或之后，被提供给需要过继性细胞疗法的受试者。在另一个方面，本发明提供了本文所述的组合物的治疗用途，该治疗用途通过将该组合物引入需要过继性细胞疗法的受试者体内，其中该受试者患有自身免疫性障碍、血液系统恶性肿瘤、实体瘤、癌症或病毒感染。

14、在又一个方面，本发明提供了在向有需要的受试者提供的过继性细胞疗法中减少或防止宿主细胞针对同种异体效应细胞的同种异体反应性的方法，其中同种异体效应细胞包括如本文所述的细胞或其群体，并且其中该方法包括cd38调节。在各种实施方案中，宿主细胞包括同种异体反应性免疫细胞，其包括原代t细胞、b细胞和/或nk细胞。在各种实施方案中，cd38调节：(i)包括在将同种异体效应细胞输注给受试者之前、期间或之后向受试者施用cd38拮抗剂；或(ii)包括在将同种异体效应细胞输注给受试者之前将cd38拮抗剂体外预负载到同种异体效应细胞；其中cd38调节(a)消除或减少同种异体反应性宿主细胞的数量；(b)将同种异体效应细胞的存活和存留延长至可由给定剂量的cd38拮抗剂控制的程度；和/或(c)延迟宿主免疫重构。在一些实施方案中，cd38拮抗剂包含：(i)抗cd38抗体或cd38-car；(ii)达雷木单抗、伊沙妥昔单抗或mor202；和/或(iii)达雷木单抗。在一些实施方案中，同种异体反应性宿主细胞包含上调的cd38表达。

15、在过继性细胞疗法中减少或防止宿主细胞对同种异体效应细胞的同种异体反应性的方法的各种实施方案中，该方法还包括向受试者施用治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂包括肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、小rna、dsrna(双链rna)、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、包括一种或多种所关注多核酸的载体、抗体、化学治疗剂或放射性部分或免疫调节药物(imid)。在特定实施方案中，(i)检查点抑制剂包含：(a)检查点分子的一种或多种拮抗剂，该检查点分子包括pd-1、pdl-1、tim-3、tigit、lag-3、ctla-4、2b4、4-1bb、4-1bbl、a2ar、bate、btla、cd39、cd47、cd73、cd94、cd96、cd160、cd200、cd200r、cd274、ceacam1、csf-1r、foxp1、garp、hvem、ido、edo、tdo、lair-1、mica/b、nr4a2、mafb、oct-2、视黄酸受体α(rara)、tlr3、vista、nkg2a/hla-e或抑制性kir；(b)阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐单抗、伊匹单抗、iph4102、iph43、iph33、利瑞木单抗、莫纳利珠单抗、纳武单抗、帕博利珠单抗和它们的衍生物或功能等效物中的一者或多者；或(c)阿特珠单抗、纳武单抗和帕博利珠单抗中的至少一者。或者(ii)该治疗剂包含维奈妥拉、阿扎胞苷和泊马度胺中的一者或多者。在一些实施方案中，该方法不需要或最少需要利用环磷酰胺和氟达拉滨(cy/flu)的组合进行的淋巴耗竭。在一些实施方案中，该方法不包括利用cy/flu进行的淋巴耗竭。

16、在另一个方面，本发明提供了治疗需要过继性细胞疗法的受试者的方法，其中该方法包括向受试者施用cd38拮抗剂以进行cd38调节并输注如本文所述的细胞或其群体。在各种实施方案中，cd38调节：(i)减少或防止宿主细胞对同种异体效应细胞的同种异体反应性；(ii)消除或减少同种异体反应性宿主细胞的数量；(iii)延长同种异体效应细胞的存活和存留；(iv)延迟宿主免疫重构；(v)经由hla-g或hla-e的过表达防止同种异体效应细胞对宿主细胞的同种异体反应性的渗漏保护；和/或(vi)增加烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)可用性，减少nad消耗相关的细胞死亡，并支持细胞再生。在一些实施方案中，该方法不需要或最少需要利用环磷酰胺和氟达拉滨(cy/flu)的组合进行的淋巴耗竭。在一些实施方案中，该方法不包括利用cy/flu进行的淋巴耗竭。

17、通过结合附图进行的以下描述，如本文所提供的组合物和方法的各个目的和优势将变得显而易见，在所述附图中借助于说明和实例阐述本发明的某些实施方案。