使用表达增强的编码重组FVIII变体的病毒载体的血友病A基因疗法的制作方法

背景技术：

1、血液凝固通过相互依赖的生化反应的复杂且动态的生物途径进行，称为凝血级联。凝血因子viii(fviii)是级联中的关键组分。因子viii被募集到出血部位，并且与活化的因子ix(fixa)和因子x(fx)形成x酶复合物。x酶复合物活化fx，fx进而将凝血酶原活化为凝血酶，然后凝血酶活化凝血级联中的其他组分以产生稳定的血块(saenko等人,trendscardiovasc.med.,9:185-192(1999)；lenting等人,blood,92:3983-3996(1998)中综述)。

2、血友病a是一种先天性x连锁出血性病症，其特征是缺乏因子viii活性。因子viii活性降低会抑制凝血级联中的正反馈回路。这会引起不完全凝血，其表现为持续时间增加的出血发作、广泛的瘀伤、自发性口腔和鼻腔出血、关节僵硬和慢性疼痛，并且严重时可能出现内出血和贫血(zhang等人,clinic.rev.allerg.immunol.,37:114-124(2009))。

3、传统上，血友病a通过因子viii替代疗法来治疗，所述疗法包括向患有血友病a的个体施用因子viii蛋白(例如血浆衍生的或重组产生的因子viii)。响应于急性出血发作，预防性地施用因子viii以预防或减少出血发作的频率，和/或围手术期地施用以控制手术期间的出血。然而，因子viii替代疗法有一些不期望的特征。

4、第一，因子viii替代疗法用于治疗或控制血友病a，但不能治愈潜在的因子viii缺陷。因此，血友病a患者终生需要因子viii替代疗法。持续治疗价格昂贵，并且需要个体严格遵守，因为仅缺少少量预防剂量就可能对患有严重血友病a的个体产生严重后果。

5、第二，由于因子viii在体内的半衰期相对较短，传统的预防性因子viii替代疗法需要每两天或三天施用一次。这给个体带来了终其一生保持依从性的负担。虽然第三代“长效”因子viii药物可能减少施用频率，但使用这些药物的预防性因子fviii替代疗法仍然需要每月、每周或更频繁地永久施用。例如，使用eloctatetm[抗血友病因子(重组)、fc融合蛋白]的预防性治疗需要每三至五天施用一次(eloctatetmprescribing information,biogenidec inc.,(2015))。此外，化学修饰生物制剂(例如，聚乙二醇化多肽)的长期影响尚未完全了解。

6、第三，接受因子viii替代疗法的所有个体中有15％至30％形成抗因子viii抑制剂抗体，导致治疗效率低下。因子viii旁路疗法(例如，施用血浆衍生的或重组产生的凝血酶原复合物浓缩物)可用于治疗形成抑制剂抗体的个体的血友病。然而，因子viii旁路疗法不如因子viii替代疗法有效(mannucci,j.thromb.haemost.,1(7):1349-55(2003))并且可能与心血管并发症的风险增加相关(luu和ewenstein,haemophilia,10增刊2:10-16(2004))。

7、体细胞基因疗法对于治疗血友病a具有巨大的前景，因为它可以纠正潜在的功能性因子viii活性表达不足(例如，由于错义或无义突变)，而不是向个体提供一次性剂量的因子viii活性。由于作用机制的这种差异，与因子viii替代疗法相比，一次性施用因子viii基因疗法载体可为个体提供数年的因子viii，从而降低治疗成本并消除对患者的持续依从性的需要。

8、凝血因子ix(fix)基因疗法已被有效用于治疗患有血友病b的个体，血友病b是一种特征在于因子ix活性降低的相关血液凝固病状(manno等人,nat.med.,12(3):342-47(2006))。然而，因子viii基因疗法提出了若干项独特的挑战。例如，全长野生型因子viii多肽(2351个氨基酸；uniprot登录号p00451)比全长野生型因子ix多肽(461个氨基酸；uniprot登录号p00740)大五倍。因此，野生型因子viii的编码序列为7053个碱基对，太大而无法包装在常规aav基因疗法载体中。此外，已报道的因子viii的b结构域缺失变体(bdd-fviii)的重组表达较差。因此，若干个小组尝试改变bdd-fviii构建体的密码子使用，但取得的成功有限。

技术实现思路

1、因此，需要其编码序列能够更高效地包装到基因疗法载体中并经由基因疗法载体递送的因子viii变体。还需要更高效地表达因子viii的合成的、密码子改变的核酸。此类因子viii变体和密码子改变的核酸允许改进对因子viii缺陷(例如，血友病a)的治疗。所公开的密码子改变的因子viii变体减少或消除了上述缺陷以及与因子viii缺陷(例如，血友病a)的治疗相关的其他问题。

2、根据一些实施方案，本公开提供了核酸，所述核酸编码与所公开的密码子改变的因子viii重链(例如，cs04-hc-na)和轻链(例如，cs04-lc-na)序列具有高序列同一性的因子viii变体。在一些实施方案中，这些核酸还包括编码因子viii重链和轻链的序列之间的编码接头序列的序列，所述接头序列替代天然因子viii b结构域(例如，包含弗林蛋白酶切割位点的接头序列)。

3、在一个方面，本公开提供了一种多核苷酸，其包括编码因子viii多肽的核苷酸序列。因子viii多肽包括轻链、重链以及将重链的c末端接合至轻链的n末端的多肽接头。因子viii多肽的重链由与cs04-hc-na(seq id no:3)具有至少95％同一性的第一核苷酸序列编码。因子fviii多肽的轻链由与cs04-lc-na(seq id no:4)具有至少95％同一性的第二核苷酸序列编码。多肽接头包含弗林蛋白酶切割位点。

4、在上述多核苷酸的一个实施方案中，多肽接头由与bdlo04(seq id no:6)具有至少95％同一性的第三核苷酸序列编码。

5、在上述多核苷酸的一个实施方案中，编码因子viii多肽的重链的第一核苷酸序列与相应的重链序列(例如，cs04-hc-na(seq id no:3))具有至少96％的同一性，并且编码因子fviii多肽的轻链的第二核苷酸序列与相应的轻链序列(例如，cs04-lc-na(seq id no:4))具有至少96％的同一性。

6、在上述多核苷酸的一个实施方案中，编码因子viii多肽的重链的第一核苷酸序列与相应的重链序列(例如，cs04-hc-na(seq id no:3))具有至少97％的同一性，并且编码因子fviii多肽的轻链的第二核苷酸序列与相应的轻链序列(例如，cs04-lc-na(seq id no:4))具有至少97％的同一性。

7、在上述多核苷酸的一个实施方案中，编码因子viii多肽的重链的第一核苷酸序列与相应的重链序列(例如，cs04-hc-na(seq id no:3))具有至少98％的同一性，并且编码因子fviii多肽的轻链的第二核苷酸序列与相应的轻链序列(例如，cs04-lc-na(seq id no:4))具有至少98％的同一性。

8、在上述多核苷酸的一个实施方案中，编码因子viii多肽的重链的第一核苷酸序列与相应的重链序列(例如，cs04-hc-na(seq id no:3))具有至少99％的同一性，并且编码因子fviii多肽的轻链的第二核苷酸序列与相应的轻链序列(例如，cs04-lc-na(seq id no:4))具有至少99％的同一性。

9、在上述多核苷酸的一个实施方案中，编码因子viii多肽的重链的第一核苷酸序列与相应的重链序列(例如，cs04-hc-na(seq id no:3))具有至少99.5％的同一性，并且编码因子fviii多肽的轻链的第二核苷酸序列与相应的轻链序列(例如，cs04-lc-na(seq idno:4))具有至少99.5％的同一性。

10、在上述多核苷酸的一个实施方案中，编码因子viii多肽的重链的第一核苷酸序列与相应的重链序列(例如，cs04-hc-na(seq id no:3))具有至少99.9％的同一性，并且编码因子fviii多肽的轻链的第二核苷酸序列与相应的轻链序列(例如，cs04-lc-na(seq idno:4))具有至少99.9％的同一性。

11、在上述多核苷酸的一个实施方案中，编码因子viii多肽的重链的第一核苷酸序列是cs04-hc-na(seq id no:3)，并且编码因子fviii多肽的轻链的第二核苷酸序列是cs04-lc-na(seq id no:4)。

12、在一个方面，本公开提供了一种多核苷酸，其包含与cs04-fl-na具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码因子viii多肽。

13、在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与相应的全长多核苷酸序列(例如，cs04-fl-na(seq id no:1))具有至少96％的同一性。

14、在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与相应的全长多核苷酸序列(例如，cs04-fl-na(seq id no:1))具有至少97％的同一性。

15、在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与相应的全长多核苷酸序列(例如，cs04-fl-na(seq id no:1))具有至少98％的同一性。

16、在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与相应的全长多核苷酸序列(例如，cs04-fl-na(seq id no:1))具有至少99％的同一性。

17、在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与相应的全长多核苷酸序列(例如，cs04-fl-na(seq id no:1))具有至少99.5％的同一性。

18、在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与相应的全长多核苷酸序列(例如，cs04-fl-na(seq id no:1))具有至少99.9％的同一性。

19、在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列是cs04-fl-na(seq id no:1)。

20、在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码因子viii多肽，所述多肽包含与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少95％同一性的氨基酸序列。

21、在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码因子viii多肽，所述多肽包含与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少96％同一性的氨基酸序列。

22、在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码因子viii多肽，所述多肽包含与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少97％同一性的氨基酸序列。

23、在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码因子viii多肽，所述多肽包含与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少98％同一性的氨基酸序列。

24、在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码因子viii多肽，所述多肽包含与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少99％同一性的氨基酸序列。

25、在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码因子viii多肽，所述多肽包含与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少99.5％同一性的氨基酸序列。

26、在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码因子viii多肽，所述多肽包含与cs04-fl-aa(seq id no:2)具有至少99.9％同一性的氨基酸序列。

27、在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸编码因子viii多肽，所述多肽包含cs04-fl-aa(seq id no:2)的氨基酸序列。

28、在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由cs04-fl-na、cs04-hc-na和cs04-lc-na组成的组的序列具有至少95％同一性。

29、在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由cs04-fl-na、cs04-hc-na和cs04-lc-na组成的组的序列具有至少96％同一性。

30、在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由cs04-fl-na、cs04-hc-na和cs04-lc-na组成的组的序列具有至少97％同一性。

31、在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由cs04-fl-na、cs04-hc-na和cs04-lc-na组成的组的序列具有至少98％同一性。

32、在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由cs04-fl-na、cs04-hc-na和cs04-lc-na组成的组的序列具有至少99％同一性。

33、在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由cs04-fl-na、cs04-hc-na和cs04-lc-na组成的组的序列具有至少99.5％同一性。

34、在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列与选自由cs04-fl-na、cs04-hc-na和cs04-lc-na组成的组的序列具有至少99.5％同一性。

35、在上述多核苷酸的一个实施方案中，核苷酸序列选自由cs04-fl-na、cs04-hc-na和cs04-lc-na组成的组。

36、在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸还包括启动子元件，其可操作地连接至编码因子viii多肽的多核苷酸。

37、在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸还包括增强子元件，其可操作地连接至编码因子viii多肽的多核苷酸。

38、在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸还包括聚腺苷酸化元件，其可操作地连接至编码因子viii多肽的多核苷酸。

39、在上述多核苷酸的一个实施方案中，多核苷酸还包括内含子元件，其可操作地连接至编码因子viii多肽的核苷酸序列。

40、在上述多核苷酸的一个实施方案中，内含子位于编码因子viii多肽的核苷酸序列的启动子元件与翻译起始位点(例如，第一编码atg)之间。

41、在另一个方面，本公开提供了一种哺乳动物基因疗法载体，其包括如本文所述的多核苷酸。

42、在本文所述的哺乳动物基因疗法载体的一个实施方案中，哺乳动物基因疗法载体是腺相关病毒(aav)载体。

43、在上述哺乳动物基因疗法载体的一个实施方案中，aav载体是aav-8载体。

44、在另一个方面，本公开提供了一种用于治疗血友病a的方法，其包括向有需要的患者施用如本文所述的哺乳动物基因疗法载体。

45、在另一个方面，本公开提供了一种如上所述的用于治疗血友病a的哺乳动物基因疗法载体。

46、在另一个方面，本公开提供了如上所述的哺乳动物基因疗法载体用于制造用于治疗血友病a的药物的用途。