一种重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法及其载体文库与流程

本发明涉及一种重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法及其载体文库。本专利申请为2021年7月6日提交的韩国专利申请第10-2021-0088575号要求优先权，并且所述专利申请的公开内容通过引用并入本文。

背景技术：

1、呼肠孤病毒科(reoviridae)病毒为以双链rna为基因组的病毒家族之一，其基因组片段包装在多层衣壳内，不包括含脂质的外壳，具有尺寸约为70nm至85nm的多面体形状。所述呼肠孤病毒科分为光滑呼肠孤病毒(sedoreovirinae)和刺突呼肠孤病毒(spinareovirinae)亚科，其感染主要影响消化或呼吸器官。轮状病毒(human rotavirus，hrv)是引起婴幼儿腹泻的主要病毒，据了解，韩国及世界各地95％的5岁以下儿童至少感染过一次，约占全球每年发生的腹泻病例的40％。轮状病毒感染症由轮状病毒显性感染所致，主要传播途径为粪-口感染，潜伏期约为24小时至72小时。这种疾病会引起呕吐、发烧和血性水样腹泻，从而导致脱水，主要发生于婴幼儿或儿童，但偶尔在老年病房发生群体性暴发。

2、轮状病毒具有由11个dsrna片段组成的基因组，无包膜，呈正二十面体，直径约为75nm，由外衣壳、内衣壳、核心蛋白三层蛋白衣壳组成。每个片段编码六个结构蛋白(vp1、vp2、vp3、vp4、vp6和vp7)和五个非结构蛋白中的任一个。所述轮状病毒分为a组至h组8个类型，a、b、c组感染在人类中常见，尤其是a组感染。所述a组轮状病毒根据vp4和vp7蛋白分为p或g血清型(serotype)，具体地，蛋白酶敏感性蛋白vp4决定p血清型，糖蛋白vp7决定g血清型，其组合决定轮状病毒的血清型。由于针对所述血清型的基因分别传递给子代病毒，因此可能会出现各种形式的组合，特别是每个具有这些各种形式组合的轮状病毒的血清型具有不提供交叉保护的特征。

3、由于轮状病毒不提供血清型间交叉保护的特性，因此需要开发能够预防各血清型感染的有效轮状病毒疫苗。目前为止，已使用口服减毒活疫苗和动物-人重组疫苗，但对其他血清型的感染没有表现出足够的保护能力，美国wyeth-ayerst公司开发的rotashield为一种与发病率最高的g血清型(g1-g4)混合的四价减毒活疫苗，获得fda批准并纳入基本疫苗接种，但由于出现肠道重叠患者而停止使用。因此，作为针对轮状病毒感染的疫苗材料，对天然/人工产生/制备的重配轮状病毒(包括病毒样颗粒)的兴趣正在增加。

4、另一方面，重配轮状病毒(reassortant rotavirus)为当单个细胞同时感染多种病毒株(strain)时，不同病毒株的rna片段组合而成的病毒，可以自然界中自发产生，但其出现的概率很低，即使发生重配，也很难分离出来，因为与野生型病毒相比，其减毒程度非常高。另外，也可以通过用牛(bovine)轮状病毒和人(human)轮状病毒同时感染单个人工培养细胞的方式产生重配轮状病毒，但这与亚型病毒相比，所产生的量也非常少，并且被减毒，若不施加选择压力(selective pressure)，则随着传代的进行，其比例逐渐降低，从而存在分离和回收所需的重配轮状病毒非常困难的缺点。为了解决这些问题，正在引入使用对待替换基因的蛋白质具有特异性中和抗体来筛选重配轮状病毒的额外过程，但存在技术限制，因为应该提前解决确保具有所述功能的单克隆中和抗体的问题，并且需要针对每种血清型进行单独的筛选过程。

5、在此技术背景下，作为开发针对包括轮状病毒在内的呼肠孤病毒科病毒的疫苗的一部分，正在进行各种研究以有效地制备重配病毒(韩国专利公开第10-2019-0108882号)，但仍存在不足。

技术实现思路

1、技术问题

2、本发明的一方面提供一种重配呼肠孤病毒科(reoviridae)病毒的制备方法，其使用已引入rna聚合酶基因的细胞系和根据一方面的轮状病毒表达载体文库。

3、本发明的另一方面提供一种通过所述方法制备的重配呼肠孤病毒科病毒及包括其的免疫原性组合物。

4、本发明的又一方面提供一种用于制备重配轮状病毒的表达载体文库。

5、下面，结合所附权利要求书和附图进行详细说明，以使本技术的其他目的和优点更加清楚。对于本说明书中未记载的内容，本技术所属领域或相似技术领域的技术人员可以充分认识和推断，因此不再赘述。

6、技术方案

7、本发明的一方面提供一种重配呼肠孤病毒科(reoviridae)病毒的制备方法，其包括：用含有外源基因的表达载体文库转染已引入rna聚合酶(rna polymerase)基因的第一细胞系；将所述转染的第一细胞系在生长培养基中培养以形成第一培养物；通过将第二细胞系添加到所述培养的第一培养物中来培养第二培养物；和通过向所述培养的第二培养物中添加胰蛋白酶来培养第三培养物，其中，所述表达载体文库包括呼肠孤病毒科病毒基因片段cdna和可与所述rna聚合酶结合的启动子。

8、本文所用的术语，“呼肠孤病毒科(reoviridae)”病毒为以双链rna为基因组的病毒家族之一，其基因组片段包装在多层衣壳内，不包括含脂质的外壳，具有尺寸约为70nm至85nm的多面体形状。所述呼肠孤病毒科病毒例如可以选自轮状病毒(rotavirus)属、卡多呼肠孤病毒(cardoreovirus)属、米莫呼肠孤病毒(mimoreovirus)属、环状病毒(orbivirus)属、植物呼肠弧病毒(phytoreovirus)属、东南亚十二节段rna病毒(seadornavirus)属、水产呼肠孤病毒(aquareovirus)属、科罗拉多壁蝨热病毒(coltivirus)属、质型多角体病毒(cypovirus)属、迪诺维纳病毒(dinovernavirus)属、斐济病毒(fijivirus)属、昆虫非包涵体病毒(idnoreovirus)属、真菌呼肠孤病毒(mycoreovirus)属、正呼肠孤病毒(orthoreovirus)属和水稻病毒(oryzavirus)属中的任一病毒，例如可以为轮状病毒属、呼肠孤病毒属、环状病毒属或科罗拉多壁蝨热病毒属的病毒，例如可以为轮状病毒。

9、所述呼肠孤病毒科病毒在细胞质繁殖并随着细胞破坏而释放，引起人类、鱼类、昆虫和植物等多种宿主的感染，在这些病毒中，已知轮状病毒属、呼肠孤病毒属、环状病毒属或科罗拉多壁蝨热病毒属的病毒会影响人类。相应地，正在进行各种研究来制备用于预防呼肠孤病毒科病毒感染的疫苗组合物，特别是活疫苗，但由于双链rna基因组分为多个片段的遗传特征以及各种血清型的存在，存在困难。另一方面，由于rna本身的不稳定性以及由此导致的细胞内递送的困难，通过将每个合成的病毒(viral)rna片段直接递送至细胞来制备的现有方法难以应用于由多个基因片段组成的呼肠孤病毒科病毒的制备。另外，通过质粒dna的制备方法利用宿主细胞的转录和rna修饰机制，其问题在于，由于额外的引入细胞核的输入过程导致递送效率降低，以及由于宿主细胞内存在有限量的聚合酶而引起启动子之间的竞争反应导致转录效率降低。在此技术背景下，本发明的目的在于解决现有技术的这些问题，证实了可以通过使用稳定表达t7 rna聚合酶的细胞系和根据一方面的表达载体文库等来获得/制备重配呼肠孤病毒科病毒，据此完成了本发明。

10、下面将详细描述所述重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法的每个步骤。

11、首先，所述方法可以包括：用含有外源基因的表达载体文库转染已引入rna聚合酶(rna polymerase)基因的第一细胞系。

12、如本文所用，术语“rna聚合酶(rna polymerase)”是指从dna合成初级转录物(primary transcript)rna的酶。所述rna聚合酶例如可以为t7 rna聚合酶、t3 rna聚合酶、sp6 rna聚合酶或线粒体聚合酶(polrmt)，具体地，在细胞质中作用的rna聚合酶，更具体地，可以t7 rna聚合酶。所述t7 rna聚合酶(t7 rna polymerase)为噬菌体t7的基因产物，与其他rna聚合酶不同，由于所述t7 rna聚合酶在细胞质(cytosol)中而不在细胞核中起作用，因此需要额外的引入细胞核的过程，与此同时，所述t7 rna聚合酶表现出优异的转录效率，从而可以同时转录由多个基因片段组成的呼肠孤病毒科病毒各自的cdna质粒。

13、本文所用的术语“表达载体文库(expression vector library)”为针对多个呼肠孤病毒科病毒基因片段的独立表达载体的集合，例如，当所述表达载体文库用于表达轮状病毒时，所述表达载体文库可以用于表达vp1、vp2、vp3、vp4、vp6、vp7、nsp1、nsp2、nsp3、nsp4和nsp5基因片段。例如，所述轮状病毒表达载体文库可以指针对vp1、vp2、vp3、vp4、vp6、vp7、nsp1、nsp2、nsp3、nsp4和nsp5的共11种表达载体的组合，每个所述基因片段选择一个，所述表达载体分别可以包括可与rna聚合酶结合的启动子和轮状病毒基因片段cdna。

14、本文所用的术语，“转染(transfection)”是指将纯化的病毒核酸或质粒引入真核细胞中，例如，所述转染可以包括将rna聚合酶，例如t7 rna聚合酶基因插入/引入细胞中，或将呼肠孤病毒科病毒片段基因插入/引入细胞中。

15、在一具体实施例中，所述第一细胞系为遗传引入rna聚合酶和外源基因的细胞系，并且可以为bhk21细胞系、hek293细胞系、hela细胞系、cho细胞系、lncap细胞系、a549细胞系，或hepg2细胞系，例如可以为表达rna聚合酶的bhk21细胞系。其中，术语“外源基因”是指待重配的呼肠孤病毒科病毒的基因，具体地，呼肠孤病毒科病毒基因片段cdna，所述每个基因片段cdna可以从相同个体或不同个体中分离/获得。例如，第一细胞系可以通过将含有组成型启动子(constitutive promoter)和与其可操作地连接的t7 rna聚合酶基因的表达载体引入bhk21细胞系中，然后从所述细胞系中选择高表达细胞系来制备，但不限于此。

16、在一具体实施例中，所述表达载体文库的总dna重量可以为每1×104至1×106细胞1ug至20ug，例如1ug至17ug、1ug至14ug、1ug至11ug、1ug至8ug、1ug至5ug、1ug至2ug、5ug至20ug、5ug至17ug、5ug至14ug、5ug至11ug、5ug至8ug、10ug至20ug、10ug至17ug、10ug至14ug或10ug至11ug。若总dna重量太低或太高，超出所述范围，则由于呼肠孤病毒科病毒的遗传特征，所需重配病毒的产量会显着减少或根本无法获得。

17、在一具体实施例中，所述表达载体文库可以包括可与所述rna聚合酶结合的启动子，例如可以为t7启动子、sp6启动子或cmv启动子。

18、在一具体实施例中，所述表达载体文库还可以包括针对编码加帽酶的d1r或d12l的表达载体。例如，由于所述t7 rna聚合酶在细胞质中转录的rna处于未发生加帽或多聚腺苷酸化的状态，因此为了提高其稳定性，可以将所述表达载体选择性地添加到呼肠孤病毒科病毒表达载体文库中。然而，对轮状病毒而言，由于vp3的存在，可以选择性地包括所述表达载体，同样，在其他呼肠孤病毒科病毒中，也可以选择性地包括针对d1r或d12l的表达载体。其中，针对所述d1r或d12l的表达载体与针对呼肠孤病毒科病毒基因片段的表达载体的摩尔比可以为1：4至1：6，例如，所述表达载体的摩尔比可以为1：4至1：5.5、1：4至1：5.0、1：4至1：4.5、1：4.5至1：6.0、1：4.5至1：5.5、1：4.5至1：5.0、1：5.0至1：6.0或者1：5.0至1：5.5，但不限于此，只要其在能够维持上述转录的rna的稳定性的范围内即可。

19、然后，所述方法可以包括：将所述转染的第一细胞系在生长培养基中培养以形成第一培养物。

20、在一具体实施例中，所述生长培养基可以为dmem(dulbeco'smodified eagle'smedium)、emem(eagle's minimum essential medium)或gmem(glasgow minimumessential medium)，所述生长培养基可以任选地添加胎牛血清(fbs)。若使用已添加胎牛血清的生长培养基，则作为后续步骤，还可以包括：更换为未添加胎牛血清的培养基。

21、在一具体实施例中，更换所述培养基可以在作为后续步骤的培养第三培养物之前进行，所述步骤例如可以在转染后20小时进行，具体地，可以在转染后20小时至24小时中的任一时间点、转染后24小时至28小时中的任一时间点或转染后28小时至32小时中的任一时间点进行。

22、所述培养可以在30℃至38℃，例如30℃至36℃、30℃至34℃、30℃至32℃、32℃至38℃、32℃至36℃、32℃至34℃、34℃至38℃、34℃至36℃或36℃至38℃的条件下，进行1小时至4小时，例如1小时至3小时、1小时至2小时、2小时至4小时、2小时至3小时或3小时至4小时。

23、然否，所述方法可以包括：通过将第二细胞系添加到所述培养的第一培养物中来培养第二培养物。

24、本文所用的术语，“第一培养物”是指通过将上述转染的第一细胞系在生长培养基中培养而获得的产物，可以包括上述转染的细胞系和生长培养基成分。

25、本文所用的术语，“第二培养物”是指通过将上述转染的第一细胞系在生长培养基中培养而获得的产物，即，通过向第一培养物添加第二细胞系而得到的物质，可以包括转染的细胞系、生长培养基成分和第二细胞系。

26、在一具体实施例中，所述第二细胞系用于促进所制备的重配呼肠孤病毒科病毒的增殖/扩增，例如，ma104细胞系、vero细胞系、hek细胞系、人肠上皮细胞、ht-29细胞系、caco2细胞系、llc-mk2细胞系、frhl-2细胞系、cv-1细胞系、cos-7细胞系、bsc-1细胞系或bgm细胞系，例如，作为猴肾细胞系的ma104细胞系。

27、所述培养第二培养物为诱导从转染的细胞产生的重配呼肠孤病毒科病毒扩增的步骤，通过将所述转染的细胞系与对呼肠孤病毒科病毒具有优异的敏感性和复制能力的第二细胞系一起培养，可以扩增初步少量产生的重配轮状病毒。其中，所述第二细胞系可以以1×102个细胞/孔至3×106个细胞/孔至，例如1×102个细胞/孔至3×105个细胞/孔、1×102个细胞/孔至3×104个细胞/孔、1×102个细胞/孔至3×103个细胞/孔、1×102个细胞/孔至3×102个细胞/孔、3×102个细胞/孔至3×106个细胞/孔、3×102个细胞/孔至3×105个细胞/孔、3×102个细胞/孔至3×104细胞/孔或者3×102个细胞/孔至3×103个细胞/孔的浓度添加。

28、在一具体实施例中，在所述培养第二培养物中，所述第二细胞系可以在转染后6小时至12小时，例如转染后6小时至8小时中的任一时间点、转染后8小时至10小时中的任一时间点或转然后10小时至12小时、12小时至14小时或14小时至18小时中的任一时间点添加到第一培养物，若添加时间太早或太晚，超出所述范围，则由于呼肠孤病毒科病毒的遗传特性，所需重配病毒的产量会显着减少或根本无法获得。

29、所述培养第二培养物可以在30℃至38℃，例如30℃至36℃、30℃至34℃、30℃至32℃、32℃至38℃、32℃至36℃、32℃至34℃、34℃至38℃、34℃至36℃或36℃至38℃的条件下，进行24小时至36小时，例如24小时至32小时、24小时至28小时、28小时至36小时、28小时至32小时或32小时至36小时。

30、然否，所述方法可以包括：通过向所述培养的第二培养物中添加胰蛋白酶来培养第三培养物。

31、本文所用的术语，“第三培养物”是指通过在培养第二培养物得到的产物中添加胰蛋白酶而获得的物质，可以包括上述转染的第一细胞系、第二细胞系、不含胎牛血清的培养基组分和适量的胰蛋白酶。

32、所述培养第三培养物为诱导重配呼肠孤病毒科病毒重新感染的步骤，通过在上述培养基中添加胰蛋白酶进行培养，可以将少量的重配呼肠孤病毒科病毒重新感染到第二细胞系中。其中，所述胰蛋白酶可以以0.1ug/ml至1ug/ml，例如0.1ug/ml至0.8ug/ml、0.1ug/ml至0.6ug/ml、0.1ug/ml至0.4ug/ml、0.1ug/ml至0.2ug/ml、0.3ug/ml至1ug/ml、0.3ug/ml至0.8ug/ml、0.3ug/ml至0.6ug/ml或0.3ug/ml至0.4ug/ml的浓度添加。

33、在一具体实施例中，在所述培养第三培养物中，所述胰蛋白酶可以在转染后36小时至54小时，例如转染后36小时至48小时，例如转染后36小时至42小时、转然后42小时至48小时或转染后48小时至54小时中的任一时间点添加到第二培养物。若添加时间太早，超出所述范围，则存在所述细胞系过早从平板上分离的风险，若添加时间太晚，则由于呼肠孤病毒科病毒的遗传特征，所需重配病毒的产量会显着减少或根本无法获得。

34、所述培养第三培养物可以进行48小时至84小时，例如48小时至72小时、48小时至60小时、60小时至84小时、60小时至72小时或72小时至84小时，并且通过已知的方法，可以进一步进行从如上所述培养的培养物中获得重配呼肠孤病毒科病毒。

35、根据一方面的方法，通过所述一系列方法制备的重配呼肠孤病毒科病毒可以根据表达载体文库选择性地具有任一个血清型或组合，无需单独的筛选过程，即可制备有效量的重配病毒。

36、本发明的另一方面提供一种通过所述方法制备的重配呼肠孤病毒科病毒及包括其的免疫原性组合物。

37、以下重配呼肠孤病毒科病毒和免疫原性组合物中提及的术语或组件中，所述制备方法描述中提及的术语或组件与上述相同。

38、如本文所用，术语“免疫原性”是指组合物诱导针对特定病原体的免疫反应的能力，所述免疫反应可以为一种细胞免疫反应，主要由细胞毒性t细胞和产生细胞因子的t细胞介导，也可以为一种体液免疫反应，主要由辅助t细胞介导，然后激活b细胞产生抗体。

39、所述免疫原性组合物可以包括与一种或多种载体、药学上可接受的稳定剂和佐剂配合的修饰的活病毒。适合使用的载体可以包括盐水、磷酸盐缓冲盐水、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、谷氨酸单钠、最低必需培养基(mem)或mem和hepes缓冲剂。所述稳定剂有助于保持病毒的活力和感染性，特别是在冻干工艺过程中以及冻干产品在冷藏温度和室温下长期储存足以实现冷链(cold chain)短期运输的一段时间内，例如，还可以包括选自人血清白蛋白和/或胶原蛋白或水解胶原蛋白或明胶或水解明胶的蛋白质稳定剂，或选自蔗糖、甘露醇、山梨醇、海藻糖、葡聚糖的糖稳定剂。另外，可以包括增强病毒的免疫原性且通过单次施用诱导保护性免疫的佐剂，并且还可以包括选自由乳糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖的填充剂。除此之外，还可以包括与病毒活疫苗的配制相关的已知成分。

40、所述免疫原性组合物可以为本领域已知的任何形式，例如但不限于液剂和注射剂形式。对液剂或注射剂而言，如果需要，其可以包括10％至40％的丙二醇和足以防止溶血现象的量(例如约1％)的氯化钠。所述液剂或注射剂可以含有本领域已知的任何稀释剂或缓冲剂。另外，所述免疫原性组合物可以在使用前立即制备，将重配呼肠孤病毒科病毒储存在容器如小瓶中，并在使用前向注射剂中添加必要的载体、佐剂、盐水等。

41、又一方面提供一种用于制备重配轮状病毒的表达载体文库，其包括多个表达载体，所述表达载体包括可与t7 rna聚合酶结合的t7启动子和与所述启动子可操作地连接的轮状病毒基因片段cdna，所述表达载体包括vp1、vp2、vp3、vp4、vp6、vp7、nsp1、nsp2、nsp3、nsp4和nsp5中任一种的基因片段cdna。

42、以下用于制备重配轮状病毒的表达载体文库中提及的术语或组件中，所述制备方法描述中提及的术语或组件与上述相同。

43、本文所用的术语，“重配轮状病毒(reassortant rotavirus)”是指由两个或多个来源的构成轮状病毒的11个dsrna片段组合而成的病毒，可以与重组轮状病毒或人工重组轮状病毒互换使用。所述重配轮状病毒的dsrna片段由6个结构蛋白(vp1、vp2、vp3、vp4、vp6和vp7)和5个非结构蛋白(nsp1、nsp2、nsp3、nsp4和nsp5)组成。具体而言，已知vp1作为存在于病毒颗粒核心内的rna聚合酶，合成用于复制rna片段的mrna，vp2形成病毒颗粒的核心，vp3作为鸟苷酸转移酶，催化由于mrna转录后修饰而发生的5'帽的附加反应，从而有助于mrna稳定。另外，vp4作为存在于病毒表面的外壳蛋白，参与病毒的细胞侵入，并在确定p血清型中发挥作用。此外，已知vp6作为衣壳的主要成分，表现出高抗原性，vp7作为存在于病毒表面的外壳蛋白，并在确定g血清型中发挥作用。

44、本文所用的术语，“载体”作为允许在适当的宿主细胞中表达靶蛋白的基因构建体，是指含有可操作地连接以表达基因插入物的调控因子的基因构建体。根据一实施例的载体可以包括表达调控因子，例如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号和/或增强子，并且载体的启动子可以为组成型或诱导型。另外，所述载体可以为可在宿主细胞中稳定表达靶物质的表达载体。作为所述用于表达的载体，可以使用本领域常用的表达载体，其用于在植物、动物或微生物中表达外源蛋白质。所述重组载体可以通过本领域已知的各种方法构建。例如，所述载体可以包括用于选择含有载体的宿主细胞的选择性标记，若载体为可复制的，则可以包括复制起点。另外，载体可以自我复制或引入到宿主dna中，所述载体可以选自质粒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒和牛痘病毒。

45、所述载体可以包括可与rna聚合酶结合的启动子，例如t7启动子、sp6启动子或cmv启动子。所述载体可以包括在动物细胞，优选地，哺乳动物细胞中可操作的启动子。根据一实施例，合适的启动子可以包括源自哺乳动物病毒的启动子和源自哺乳动物细胞基因组的启动子，例如，可以包括巨细胞病毒(cytomegalovirus，cmv)启动子、u6启动子和h1启动子、鼠白血病病毒(murine leukemia virus，mlv)、腺病毒早期启动子、腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5k启动子、sv40启动子、hsv的tk启动子、rsv启动子、ef1α启动子、金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人il-2基因的启动子、人ifn基因的启动子、人il-4基因的启动子、人淋巴毒素基因的启动子、人gm-csf基因的启动子、人磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子、小鼠磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子和存活蛋白(survivin)启动子。在一具体实施例中，所述载体可以为包括轮状病毒基因片段cdna或编码加帽酶的dna的质粒载体，例如，可以为具有图2或图3的切割图的质粒。

46、在一具体实施例中，所述重配轮状病毒具有g1、g2、g3、g4、g9和p1中任一个血清型，并且在用于制备重配轮状病毒的表达载体内的轮状病毒基因片段cdna中，所述vp4基因片段cdna可以包括seq id no：5或6的碱基序列，所述vp7基因片段cdna可以包括seq idno：8、9、10、11、12或13的碱基序列。所述vp4和vp7基因组片段决定重配轮状病毒的血清型，并且通过与其他vp1、vp2、vp3、vp6、nsp1、nsp2、nsp3、nsp4和nsp5组合，可以制备具有所需血清型的重配轮状病毒。

47、在一具体实施例中，在所述用于制备重配轮状病毒的表达载体内的轮状病毒基因片段cdna中，所述vp1基因片段cdna可以包括seq id no：1的碱基序列；所述vp2基因片段cdna可以包括seq id no：2的碱基序列；所述vp3基因片段cdna可以包括seq id no：3或4的碱基序列；所述vp6基因片段cdna可以包括seq id no：7的碱基序列；所述nsp1基因片段cdna可以包括seq id no：14的碱基序列；所述nsp2基因片段cdna可以包括seq id no：15的碱基序列；所述nsp3基因片段cdna可以包括seq id no：16的碱基序列；所述nsp4基因片段cdna可以包括seq id no：17的碱基序列；或所述nsp5基因片段cdna可以包括seq id no：18的碱基序列。

48、在一具体实施例中，所述用于制备重配轮状病毒的表达载体文库可以由表达载体组成，所述表达载体分别包括以下组合的基因片段cdna：(a)seq id no：1的vp1 cdna、seqid no：2的vp2 cdna、seq id no：3的vp3 cdna、seq id no：5的vp4 cdna、seq id no：7的vp6cdna、seq id no：8的vp7 cdna、seq id no：14的nsp1 cdna、seq id no：15的nsp2cdna、seq id no：16的nsp3 cdna、seq id no：17的nsp4 cdna和seq id no：18的nsp5cdna；(b)seq id no：1的vp1 cdna、seq id no：2的vp2 cdna、seq id no：3的vp3 cdna、seqid no：5的vp4 cdna、seq id no：7的vp6 cdna、seq id no：9的vp7 cdna、seq id no：14的nsp1 cdna、seq id no：15的nsp2 cdna、seq id no：16的nsp3 cdna、seq id no：17的nsp4cdna和seq id no：18的nsp5 cdna；(c)seq id no：1的vp1 cdna、seq id no：2的vp2 cdna、seq id no：4的vp3 cdna、seq id no：5的vp4 cdna、seq id no：7的vp6 cdna、seq id no：10的vp7 cdna、seq id no：14的nsp1 cdna、seq id no：15的nsp2 cdna、seq id no：16的nsp3 cdna、seq id no：17的nsp4cdna和seq id no：18的nsp5 cdna；(d)seq id no：1的vp1cdna、seq id no：2的vp2 cdna、seq id no：4的vp3 cdna、seq id no：5的vp4 cdna、seqid no：7的vp6 cdna、seq id no：11的vp7 cdna、seq id no：14的nsp1 cdna、seq id no：15的nsp2cdna、seq id no：16的nsp3 cdna、seq id no：17的nsp4 cdna和seq id no：18的nsp5 cdna；(e)seq id no：1的vp1 cdna、seq id no：2的vp2 cdna、seq id no：4的vp3cdna、seq id no：5的vp4 cdna、seq id no：7的vp6 cdna、seq id no：12的vp7 cdna、seqid no：14的nsp1 cdna、seq id no：15的nsp2 cdna、seq id no：16的nsp3 cdna、seq idno：17的nsp4 cdna和seq id no：18的nsp5 cdna；以及(f)seq id no：1的vp1 cdna、seq idno：2的vp2 cdna、seq id no：4的vp3 cdna、seq id no：6的vp4 cdna、seq id no：7的vp6cdna、seq id no：13的vp7 cdna、seq id no：14的nsp1 cdna、seq id no：15的nsp2 cdna、seq id no：16的nsp3 cdna、seq id no：17的nsp4 cdna和seq id no：18的nsp5cdna。上述基因片段cdna与血清型之间的组合，去除了人轮状病毒的致病性，同时添加了对人体无害的牛轮状病毒基因，并且包括可以优化人轮状病毒免疫原性形成的表位部分(例如，vp7和vp4)，以最大化其免疫原性。

49、在一具体实施例中，所述表达载体文库可以包括表达盒，所述表达盒还包括与所述基因片段cdna侧接(flanked)的核酶编码序列。所述轮状病毒表达载体文库可以包括选自以下任一种或多种质粒：包括针对由seq id no：19的碱基序列组成的vp1基因片段的表达盒的质粒；包括针对由seq id no：20的碱基序列组成的vp2基因片段的表达盒的质粒；包括针对由seq id no：21或22的碱基序列组成的vp3基因片段的表达盒的质粒；包括针对由seq id no：23或24的碱基序列组成的vp4基因片段的表达盒的质粒；包括针对由seq idno：25的碱基序列组成的vp6基因片段的表达盒的质粒；包括针对由seq id no：26、27、28、29、30或31的碱基序列组成的vp7基因片段的表达盒的质粒；包括针对由seq id no：32的碱基序列组成的nsp1基因片段的表达盒的质粒；包括针对由seq id no：33的碱基序列组成的nsp2基因片段的表达盒的质粒；包括针对由seq id no：34的碱基序列组成的nsp3基因片段的表达盒的质粒；包括针对由seq id no：35的碱基序列组成的nsp4基因片段的表达盒的质粒；和包括针对由seq id no：36的碱基序列组成的nsp5基因片段的表达盒的质粒。进一步地，还可以制备所述表达盒的组合，以相应于上述基因片段cdna的组合。

50、在一具体实施例中，所述轮状病毒表达载体文库可以包括选自以下任一种或多种质粒：由seq id no：37的碱基序列组成的含有vp1基因组片段cdna的质粒；由seq id no：38的碱基序列组成的含有vp2基因组片段cdna的质粒；由seq id no：39或40的碱基序列组成的含有vp3基因组片段的质粒；由seq id no：41或42的碱基序列组成的含有vp4基因组片段的质粒；由seq id no：43的碱基序列组成的含有vp6基因组片段的质粒；由seq id no：44、45、46、47、48或49的碱基序列组成的含有vp7基因组片段的质粒；由seq id no：50的碱基序列组成的含有nsp1基因组片段cdna的质粒；由seq id no：51的碱基序列组成的含有nsp2基因组片段cdna的质粒；由seq id no：52的碱基序列组成的含有nsp3基因组片段cdna的质粒；由seq id no：53的碱基序列组成的含有nsp4基因组片段cdna的质粒；和由seq id no：54的碱基序列组成的含有nsp5基因组片段cdna的质粒。进一步地，还可以制备所述质粒的组合，以相应于上述基因片段cdna的组合。

51、在一具体实施例中，所述轮状病毒表达载体文库还可以包括：由seq id no：37的碱基序列组成的含有d1r的质粒；和由seq id no：38的碱基序列组成的含有d12l的质粒。

52、在一具体实施例中，所述表达载体文库中含有所述nsp2或nsp5基因片段cdna的质粒与含有vp1、vp2、vp3、vp4、vp6、vp7、nsp1、nsp3或nsp4基因片段cdna的质粒的摩尔比可以为4：1至6：1，例如，所述表达载体之间的摩尔比可以为5.0：1至5.5：1、4.0：1至5.0：1、4：1至4.5：1、4.5：1至6.0：1、4.5：1至5.5：1、4.5：1至5.0：1、5.0：1至6.0：1或5.0：1至5.5：1。若表达载体之间的摩尔比出现差异，超出所述范围，则由于重配轮状病毒的遗传特征，所需重配病毒的产量会显着减少或根本无法获得。

53、有益效果

54、根据一方面的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法，比现有的使用病毒的方法更安全，通过载体文库的随机组合，无需单独的筛选过程，即可容易、高效地获得所需的重配病毒。

55、因此，根据一方面的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法及由所述方法制备的重配呼肠孤病毒科病毒可用于针对诸如轮状病毒之类的病毒感染的病理生理学研究、预防轮状病毒感染症的疫苗领域等。

56、附图简单说明

57、图1使用荧光显微镜确认了总共3种稳定表达t7 rna聚合酶的细胞系(bhk-t7#3、#6、#7)中t7 rna聚合酶的表达和活性，图1(a)为bhk-t7#3细胞系的结果，图1(b)为bhk-t7#6细胞系的结果，图1(c)为bhk-t7#7细胞系的结果。

58、图2为可表达轮状病毒基因片段的质粒的切割图。

59、图3为辅助(helper)质粒的切割图，图3(a)为pcmvtk-d1r质粒的切割图，图3(b)为pcmvtk-d12l质粒的切割图。

60、图4为根据一实施例的使用已引入t7 rna聚合酶的细胞系和轮状病毒表达载体文库的重配轮状病毒的制备方法的示意图。

61、图5为根据一实施例的重配轮状病毒的制备过程随时间推移的示意图。

62、图6为根据一实施例的重配轮状病毒的扩增和再感染过程随时间推移的示意图。

63、图7为根据一实施例的使用电子显微镜确认了由重配轮状病毒再感染的ma104细胞中是否发生胞病变效应(cytopathic effect，cpe)现象的结果。

64、图8为根据一实施例的使用荧光显微镜确认了由重配轮状病毒再感染的ma104细胞中vp6表达的结果。