一种重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法及其载体文库与流程

文档序号:37930404发布日期:2024-05-11 00:09阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法,其包括:用含有外源基因的表达载体文库转染已引入rna聚合酶基因的第一细胞系;

2.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法,其中,所述呼肠孤病毒科病毒选自轮状病毒属、卡多呼肠孤病毒属、米莫呼肠孤病毒属、环状病毒属、植物呼肠弧病毒属、东南亚十二节段rna病毒属、水产呼肠孤病毒属、科罗拉多壁蝨热病毒属、质型多角体病毒属、迪诺维纳病毒属、斐济病毒属、昆虫非包涵体病毒属、真菌呼肠孤病毒属、正呼肠孤病毒属和水稻病毒属中的任一病毒。

3.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法,其中,所述rna聚合酶为t7 rna聚合酶、t3 rna聚合酶、sp6 rna聚合酶或线粒体聚合酶。

4.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法,其中,所述第一细胞系为bhk21细胞系、hek293细胞系、hela细胞系、cho细胞系、lncap细胞系、a549细胞系或hepg2细胞系。

5.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法,其中,所述第二细胞系为ma104细胞系、vero细胞系、hek细胞系、人肠上皮细胞、ht-29细胞系、caco2细胞系、llc-mk2细胞系、frhl-2细胞系、cv-1细胞系、cos-7细胞系、bsc-1细胞系或bgm细胞系。

6.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法,其中,在所述培养第二培养物中,转染后6小时至12小时将所述第二细胞系添加到第一培养物。

7.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法,其中,在所述培养第三培养物中,转染后36小时至48小时将所述胰蛋白酶添加到第二培养物。

8.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法,其中,所述胰蛋白酶以0.1ug/ml至1ug/ml的浓度添加。

9.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法,其中,所述启动子为t7启动子、sp6启动子或cmv启动子。

10.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法,其中,所述表达载体文库的总dna重量为每1ⅹ104至1ⅹ106个细胞1ug至20ug。

11.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法,其中,所述表达载体文库还包括针对编码加帽酶的d1r或d12l的表达载体。

12.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法,其中,当所述生长培养基为添加有胎牛血清的生长培养基时,在培养所述第三培养物之前,还包括:更换为未添加胎牛血清的培养基。

13.根据权利要求1所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法,其中,所述生长培养基为dmem、emem或gmem。

14.根据权利要求12所述的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法,其中,所述更换为未添加胎牛血清的培养基在转染后20小时执行。

15.一种通过根据权利要求1至14中任一项所述的方法制备的重配呼肠孤病毒科病毒。

16.一种用于制备重配轮状病毒的表达载体文库,其包括:多个表达载体,所述表达载体包括可与t7 rna聚合酶结合的t7启动子和与所述启动子可操作地连接的轮状病毒基因片段cdna,

17.根据权利要求16所述的用于制备重配轮状病毒的表达载体文库,其中,所述重配轮状病毒具有g1、g2、g3、g4、g9和p1中的任一种的血清型,

18.根据权利要求17所述的用于制备重配轮状病毒的表达载体文库,其中,在所述轮状病毒基因片段cdna中,所述vp1基因片段cdna包括seq id no:1的碱基序列;

19.根据权利要求16所述的用于制备重配轮状病毒的表达载体文库,其包括:表达盒,所述表达盒还包括与所述基因片段cdna侧接的核酶编码序列。

20.根据权利要求19所述的用于制备重配轮状病毒的表达载体文库,其中,所述载体为质粒。

21.根据权利要求19所述的用于制备重配轮状病毒的表达载体文库,其中,所述表达载体文库包括选自以下任一种或多种质粒:包括针对由seq id no:19的碱基序列组成的vp1基因片段的表达盒的质粒;

22.根据权利要求21所述的用于制备重配轮状病毒的表达载体文库,其中,所述表达载体文库还包括:由seq id no:55的碱基序列组成的用于表达d1r的质粒;和

23.根据权利要求21所述的用于制备重配轮状病毒的表达载体文库,其中,所述轮状病毒表达载体文库的总dna重量为每1ⅹ104至1ⅹ106个细胞1ug至20ug。

24.根据权利要求21所述的用于制备重配轮状病毒的表达载体文库,其中,包括所述nsp2或nsp5基因片段cdna的质粒与包括vp1、vp2、vp3、vp4、vp6、vp7、nsp1、nsp3或nsp4基因片段cdna的质粒之间的摩尔比为4:1至6:1。


技术总结
本申请涉及一种重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法及其载体文库,提供一种使用已引入RNA聚合酶的细胞系和根据一方面的表达载体文库的重配呼肠孤病毒科病毒的制备方法,通过所述方法制备的重配呼肠孤病毒科病毒,以及用于制备重配轮状病毒的表达载体文库。

技术研发人员:徐基元,权泰佑,郑舒娟,朴敏廷,李建世,李泫周
受保护的技术使用者:SK生物科学株式会社
技术研发日:
技术公布日:2024/5/10
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