游离DNA分离回收及基因甲基化检测方法

本发明涉及基因检测领域，具体地说，是涉及游离dna的分离回收以及基因甲基化检测。

背景技术：

1、癌症已经成为导致人类死亡的主要病种之一，且发病率和死亡率仍不断增高。影响临床疗效的主要原因是发现并诊断的时期。如能在早期(癌细胞转移前)就诊断并切除，则癌症可以达到治愈的效果。但当前的技术，多数是在中晚期才得到诊断，由于癌细胞已出现近端或远端转移，导致疗效不佳。

2、癌症早期发现一直是难点，但对治疗效果非常重要。目前，临床症状、影像学检测和组织病理学检查等，是癌症的诊断主要依据。但多数情况，癌症临床症状出现较晚，并且活体取样检查困难且有副作用，采样不便，影响癌症的早期诊断和预后。

3、近年，dna分子检测技术发展迅速，肿瘤分子标志物检测已经成为继影像诊断、病理诊断之后的肿瘤分子诊断新的领域，对肿瘤的诊断、监测和治疗意义重大。肿瘤dna标志物可以在体液中检测到，能够反映肿瘤的存在、恶性程度、对预后估计和判断治疗效果有重要意义。

4、dna突变和甲基化几乎在所有肿瘤中都有发生。高灵敏检测的技术下，肿瘤突变在中晚期多能检出。高甲基化是肿瘤发生的一个早期事件，并持续存在，在肿瘤发生发展的早期就可能被检测出来，对肿瘤早期诊断、动态风险预测、临床病程监控和疗效评估具有重要意义。

5、目前，在外周循环血的游离dna，其基因异常突变与高甲基化只占血液游离dna的极低比例，大约0.01％～1％，高比例的正常细胞死亡释放出的游离dna对极低比例的肿瘤变异游离dna只有微小的差异，是检出变异游离dna的高度复杂的“背景”，且血液游离dna已经降解为小片段(主要在170～360bp范围)，要求检测技术具有极高的灵敏度。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题之一是提供一种微量游离dna(cfdna)的分离回收方法，所述方法可以回收溶液中的微量cfdna再利用，降低检测的成本。

2、为解决上述技术问题，本发明的微量游离dna的分离回收方法，包括以下步骤：

3、1)在提取cfdna后，对cfdna片段进行加长；

4、2)以步骤1)加长后的cfdna为模板，使用与目标靶区互补的生物素修饰的单端特异引物，进行单链特异线性富集反应；

5、3)将步骤2)的产物与亲和素修饰的非磁性微球进行结合反应，分离并分别回收微球结合产物和未与微球结合的cfdna。

6、所述微量游离dna的分离回收方法步骤1)，可以使用末端转移酶，在cfdna片段末端添加包含有多聚a段和多聚g段，或者多聚t段和多聚g段的长链结构。所述长链结构的长度优选为150bp以上，长链结构中的多聚a段或多聚t段的片段长度优选为80bp以上，多聚g段的长度优选为15bp以上。

7、本发明要解决的技术问题之二是提供一种基因突变的检测方法，所述方法检测灵敏度和特异性高，检测成本低，可以检测多种肿瘤dna的基因突变。

8、为解决上述技术问题，本发明的基因突变检测方法，包括以下步骤：

9、1)以cfdna为模板，用与模板对应的5’端带有测序公共接头序列、中部带有随机碱基编码序列、3’端带有与模板靶标分子互补序列的特异引物，进行单分子标记反应；

10、2)以步骤1)的单分子标记反应产物为模板，用3’端带有与模板互补的特异增强序列、5’端带有测序对侧公共接头序列的引物和与模板5’端测序公共接头序列相同或互补的公共接头引物构成引物对，进行单端特异增强指数扩增反应；

11、3)以步骤2)的产物为模板，用双端测序公共接头引物对进行双端非特异指数扩增反应，获得测序文库，进行测序。

12、所述基因突变检测方法步骤1)中的cfdna模板，使用所述微量游离dna的分离回收方法步骤3)获得的结合于微球上的cfdna；或从检测样本中直接提取cfdna，用末端转移酶对检测样本中直接提取的cfdna片段进行加长，在cfdna片段末端添加150bp以上的多聚a段(>80bp)和多聚g段(>15bp)，或者多聚t段(>80bp)和多聚g段(>15bp)；再用与目标靶区互补的生物素修饰的单端特异引物，对加长后的cfdna进行单链特异线性富集反应；最后用亲和素修饰的非磁性微球，将将富集产物结合到微球上后，分离并回收获得cfdna模板。

13、所述基因突变检测方法步骤1)中所述的随机碱基编码序列可以由两段随机序列中间插入一段非随机序列构成。其中，随机序列的碱基数为4bp以上(优选为4～5bp)，非随机序列的碱基数优选为4～6bp。随机碱基编码序列的结构可以是：4n-a3ta-4n、4n-t3at-4n、4n-act-4n、4n-agt-4n、4n-tacgt-4n、5n-a3ta-4n、5n-a3ta-5n、4n-t3at-5n、5n-t3at-5n、4n-agct-5n、5n-agct-5n等，优选为：nnnnnatttannnn或nnnnactnnnn，序列中的n随机选自a、c、g、t。在引物合成时，随机序列各位点上的碱基(a、c、g、t)是通过随机连接得到的，非随机序列各位点上的碱基则是按照引物设计时所设定的碱基类型固定分配得到的。通过在随机序列中间插入非随机序列，隔断随机碱基，形成一个隔离区，可以提高标记引物扩增反应的特异性，减少非特异产物的形成。

14、所述基因突变检测方法步骤1)中所述特异引物的3’端与模板靶标分子互补的序列的长度为20-25bp。

15、所述基因突变检测方法步骤1)中所述的单分子标记反应，优选采用慢降温三步法热循环，反应条件优选为：95℃5分钟；95℃30秒，64℃2分钟，62℃2分钟，60℃4分钟，58℃2分钟，68℃30秒，1个循环；16℃保持。

16、本发明要解决的技术问题之三是提供一种基因甲基化检测方法，所述方法检测灵敏度和特异性高，检测成本低，可以检测多种肿瘤dna的甲基化程度。

17、为解决上述技术问题，本发明的基因甲基化检测方法，包括以下步骤：

18、1)对样本cfdna片段进行加长，得到加长后的cfdna；

19、2)用重亚硫酸盐处理步骤1)所得加长后的cfdna；

20、3)对步骤2)的产物，用单端放大引物进行线性放大；

21、4)以步骤3)的产物为模板，用生物素修饰的特异引物，进行单链特异线性靶标富集反应，再加亲和素修饰的非磁性微球，将富集产物结合到非磁性微球上；

22、5)以步骤4)的微球富集产物为模板，用与模板对应的5’端带有测序公共接头序列、中部带有随机碱基编码序列、3’端带有与模板靶标分子互补序列的特异引物，进行单分子标记反应；

23、6)以步骤5)的单分子标记反应产物为模板，用3’端带有与模板互补的特异增强序列、5’端带有测序对侧公共接头序列的引物和与模板5’端测序公共接头序列相同或互补的公共接头引物构成引物对，进行单端特异增强指数扩增反应；

24、7)以步骤6)的产物为模板，用双端测序公共接头引物对进行双端非特异指数扩增反应，获得测序文库，进行测序。

25、所述基因甲基化检测方法步骤1)中加长后的cfdna获得方法为用末端转移酶，在样本cfdna片段末端添加150bp以上的多聚a段(>80bp)和多聚g段(>15bp)，或者多聚t段(>80bp)和多聚g段(>15bp)；或使用所述微量游离dna的分离回收方法中步骤3)获得的未与微球结合的cfdna。

26、所述基因甲基化检测方法步骤3)，所述放大引物的序列优选为seq id no:8或seqidno:43所示。

27、所述基因甲基化检测方法步骤5)，所述的随机碱基编码序列可以由两段随机序列中间插入一段非随机序列构成。其中，随机序列的碱基数为4bp以上(优选为4～5bp)，非随机序列的碱基数优选为4～6bp。例如，随机碱基编码序列的结构可以是：4n-a3ta-4n、4n-t3at-4n、4n-act-4n、4n-agt-4n、4n-tacgt-4n、5n-a3ta-4n、5n-a3ta-5n、4n-t3at-5n、5n-t3at-5n、4n-agct-5n、5n-agct-5n等，优选为：nnnnnatttannnn或nnnnactnnnn，序列中的n随机选自a、c、g、t。

28、所述基因甲基化检测方法步骤5)，所述特异引物的3’端与模板靶标分子互补的序列的长度为20-25bp。

29、所述基因甲基化检测方法步骤5)，所述的单分子标记反应，优选采用慢降温三步法热循环，反应条件优选为：95℃5分钟；95℃30秒，54℃2分钟，52℃2分钟，50℃4分钟，48℃2分钟，58℃1分钟，68℃1分钟，1个循环；16℃保持。

30、本发明要解决的技术问题之四是提供一种基因突变和甲基化的联合检测方法，该方法可以提高检测的灵敏性和特异性，降低检测的成本。

31、为解决上述技术问题，本发明的基因突变和甲基化的联合检测方法，结合使用了上述游离dna的分离回收方法、基因突变检测方法、基因甲基化检测方法三种方法。一份检测样本，首先经上述游离dna的分离回收方法，分别获得加长并富集后结合在微球上的cfdna，以及加长但未富集、未与微球结合的cfdna，前者(即微球cfdna)参照上述基因突变检测方法建库，后者参照上述基因甲基化检测方法，经重亚硫酸盐处理后建库，两份测序文库合并测序，实现用一份检测样本同时完成基因突变和甲基化两种检测。

32、本发明要解决的技术问题之五是提供用于所述微量游离dna分离回收方法的试剂盒。所述试剂盒包含有与目标靶区互补的生物素修饰的单端特异引物以及亲和素修饰的非磁性微球，进一步，所述试剂盒还包含末端转移酶。

33、本发明要解决的技术问题之六是提供用于所述基因甲基化检测方法的试剂盒。所述试剂盒包含有重亚硫酸盐、用于线性放大反应的单端放大引物、生物素修饰的用于单链特异线性靶标富集反应的特异引物、亲和素修饰的非磁性微球、单分子标记引物、单端特异增强指数扩增引物和双端测序公共接头引物。其中，单分子标记引物的5’端带有测序公共接头序列、中部带有随机碱基编码序列、3’端带有与靶标分子互补的序列。进一步的，所述试剂盒还包含有末端转移酶。

34、本发明要解决的技术问题之七是提供基因甲基化检测方法的用途，所述方法可用于检测肿瘤基因的高甲基化。

35、与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

36、1.通过将样品原始dna模板加长，添加特殊的加长序列结构，在不影响原始dna序列的条件下，减少了磁珠纯化导致的损失，并为后续线性扩增放大提供了条件。

37、2.利用亲和素修饰的非磁性微球与dna富集产物的结合反应，将dna富集产物与原始dna模板分离回收，这样就使用过的dna模板可以重复利用，做其他检测。

38、3.通过进行生物素修饰的单端特异引物引导的单链线性靶标富集反应，将原始模板上系列位点的碱基转化为可分离的互补序列，再进行非磁性微球的结合和分离、回收，这一可分离富集反应提高了建库效率，避免了1000万倍的非靶标dna的竞争干扰。

39、4.对富集在非磁性微球上的单链产物用特异引物延伸法进行高效单分子标记反应，并净化去除残余的标记引物二聚体，高度去除了非靶标dna的竞争干扰，可显著提高单分子标记产物的扩增效率。

40、5.对标记后的产物进行单端特异增强指数扩增，进一步降低了建库的非特异性，提高了建库的特异性和建库质量。

41、6.重亚硫酸盐处理后的受损产物通过线性扩增，补偿了重亚硫酸盐处理所造成的损失，加倍了处理后的分子数，为提高甲基化测序的建库质量提供了良好的条件，从而提高了甲基化测序的建库效率。

42、7.对低比例肿瘤驱动突变检测的特异性高。由于采用了单分子编码溯源识别去除假阳性误差，假阳性可达到0.01％以下，特异性比常规双链pcr扩增法的2％分辨率高200倍。

43、8.可以根据分子编码溯源分析，进行初始dna分子的定量测序，计算出初始dna分子的检出数，因此可以准确进行分子数定量和突变比例定量，解决稀有低比例突变基因不能定量的问题。

44、9.一份微量游离dna样品可以同步进行两种不同类型的检测，这是现有建库测序方法做不到的，这一方面提高了检测的灵敏性和特异性，另一方面降低了检测的成本。例如，一次10～15ml血液一管采样，同时进行突变测序和甲基化测序检测，大大降低了常规两管采样的难度和昂贵的游离dna抽提成本。