鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合及其应用

本发明属于生物合成领域，具体涉及鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合及其应用。

背景技术：

1、麦角硫因(ergothioneine，简称egt)是一种天然手性氨基酸类强抗氧化剂，又名2-硫基-l-组氨酸三甲基内盐，具有很强的抗氧化、抗衰老、抗辐射活性，是细胞正常生长代谢的重要活性物质。麦角硫因极易溶于水，其水溶液可长期保持活性，相较于其他抗氧化剂性能更稳定，在强碱和正常生理ph条件下都不会发生自身氧化。因此，麦角硫因被广泛应用于医药、化妆品、食品饮料等领域。

2、麦角硫因合成基因分为真菌源和细菌源。在真菌中，合成麦角硫因需要两个合成酶egt1、2，大部分非酵母真菌如粗糙脉胞菌(neurospora crassa)、米根霉(rhizopusoryzae)、美味牛肝菌(boletus edulis)等均含有麦角硫因。细菌合成麦角硫因通常需要五个合成酶egta、b、c、d、e，目前只发现少量合成麦角硫因的细菌如结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)、耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis)、蓝细菌(certain cyanobacteria)、甲基杆菌属(methylobacterium)、放线菌(actinomycetes)。

3、由于麦角硫因化学合成法难度大、产率低并且有机溶剂残留严重，安全性无法得到保障，所以目前工业化麦角硫因主要的来源是食用菌菌丝的深层发酵提取，但其天然产量较低，虽然食药用菌子实体中的麦角硫因含量相对较高，但是在工业化制备中从大量的子实体提取麦角硫因的方法往往不是最合适的，子实体因其栽培时间长，成本高导致了其无法适宜工业化的生产。

4、从技术应用的前景来看，生物法是麦角硫因最具有潜力的生产方式，与真菌相比，利用细菌生产麦角硫因，生产周期短并且提取工艺简单。选择自身具有优良麦角硫因合成能力菌株，对其麦角硫因合成途径的关键酶基因进行强化，构建麦角硫因微生物细胞合成工厂可以让麦角硫因的生产更经济、高效。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合。

2、本发明的另一目的在于提供鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成蛋白或蛋白组合。

3、本发明的另一目的在于提供上述鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因、基因组合、蛋白或蛋白组合的应用。

4、为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

5、鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合，为下述任一基因或基因组合：(1)spegtb；(2)spegtd；(3)spegte；(4)spegtb+spegtd；(5)spegtd+spegte；(6)spegtb+spegtd+spegte；其中，spegtb的核苷酸序列如seq id no:1所示，spegtd的核苷酸序列如seqidno:3所示，spegte的核苷酸序列如seq id no:5所示。

6、上述鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合的相关生物材料，为下述生物材料中的任意一种：

7、1)所述的鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合编码的蛋白；

8、2)含有所述的鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合的表达盒；

9、3)含有所述的鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合的重组载体，或含有2)中所述的表达盒的重组载体；

10、4)含有所述的鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合的重组微生物，或含有2)中所述的表达盒的重组微生物，或含有3)所述的重组载体的重组微生物。

11、优选地，1)中所述的蛋白为下述任一蛋白或蛋白组合：(1)spegtb；(2)spegtd；(3)spegte；(4)spegtb+spegtd；(5)spegtd+spegte；(6)spegtb+spegtd+spegte；其中，spegtb的氨基酸序列如seq id no:2所示，spegtd的氨基酸序列如seq id no:4所示，spegte的氨基酸序列如seq id no:6所示。

12、优选地，3)中所述的重组载体为将所述的基因或基因组合构建到pbbr1mcs-2质粒中得到；进一步优选为将spegtb+spegtd或spegtd+spegte构建到pbbr1mcs-2质粒中得到。

13、优选地，4)中所述的重组微生物为将3)中所述的重组载体转化到鞘氨醇单胞菌中得到；进一步优选为将3)中所述的重组载体转化到鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)hbj-193中得到。

14、上述鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因、基因组合或相关材料在合成麦角硫因中应用。

15、优选地，所述的应用是所述的应用是在鞘氨醇单胞菌体内过表达所述的鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成基因或基因组合；进一步优选为在鞘氨醇单胞菌体内过表达spegtb+spegtd或spegtd+spegte。

16、优选地，所述的鞘氨醇单胞菌为鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)hbj-193。

17、一种麦角硫因的生物合成方法，包括如下步骤：

18、①表达质粒pbbr1mcs-2-spegtb-spegtd或pbbr1mcs-2-spegtd-spegte的构建：

19、利用同源重组酶同时将带有同源臂的spegtd基因片段和带有同源臂的spegtb或spegte基因片段与线性化的pbbr1mcs-2载体片段进行同源重组，得到表达质粒pbbr1mcs-2-spegtb-spegtd或pbbr1mcs-2-spegtd-spegte；

20、②重组菌hbj-193-bd或hbj-193-de的构建：

21、将达质粒pbbr1mcs-2-spegtb-spegtd或pbbr1mcs-2-spegtd-spegte采用电介导转化的方法导入鞘氨醇单胞菌hbj-193，得到重组菌hbj-193-bd或hbj-193-de；

22、③重组菌的发酵：

23、挑取重组菌hbj-193-bd或hbj-193-de单菌落至lb液体培养基，并加入卡那霉素，培养，得到种子液；取种子液加至发酵培养基并加入卡那霉素，避光培养；再次加入等量的卡那霉素，继续避光培养，结束发酵；

24、④麦角硫因分离与纯化：

25、取发酵后的培养液，加入乙醇提取液，静置获得粗提液，粗提液离心，取上清液，除杂过滤，得到麦角硫因。

26、优选地，①中所述的同源重组采用clonexpress ultra one step cloning kit试剂盒实现。

27、优选地，①中所述的同源重组的10μl反应体系组成如下：

28、

29、优选地，①中所述的同源重组的反应参数：50℃孵育30min，立即冷却。

30、优选地，③中所述的种子液的接种量为2％。

31、优选地，③中所述的避光培养的条件为28℃、150rpm、72h。

32、优选地，③中所述的卡那霉素的添加量按其与培养基的体积比为1mg：40ml计。

33、优选地，④中所述的乙醇提取液的组成如下：每1l体系中含1.67g十二烷基硫酸钠(sds)，700ml无水乙醇，水余量。

34、优选地，④中所述的乙醇提取液的添加量为发酵后的培养液的4倍体积。

35、优选地，④中所述的静置的条件为4℃、12h。

36、优选地，④中所述的离心的条件为12000r/min、10min。

37、本发明的原理：鞘氨醇单胞菌(sphingomonas sp.)hbj-193，于2022年03月29日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmcc no.24613。鞘氨醇单胞菌是普遍认为安全的菌株，工业上多用于生产胞外多糖，对于该食品源菌株的麦角硫因关键酶合成基因进行挖掘将有利于构建鞘氨醇单胞菌麦角硫因合成工厂。

38、由于鞘氨醇单胞菌的麦角硫因合成途径不明，因此我们在linux系统下利用鞘氨醇单胞菌hbj-193的基因组数据建立了本地比对核酸库，以较为近缘并且其麦角硫因合成关键基因经过功能验证的耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis)作为本地比对的输入基因与hbj-193基因组的本地核酸库进行blast比对。根据本地核酸库比对结果并结合pfam、nr数据库注释信息，拟定鞘氨醇单胞菌hbj-193的spegtb、spegtd、spegte基因分别为基因组中ge002087、ge002086、ge001348。

39、以提取鞘氨醇单胞菌hbj-193的dna为模版，设计特异性引物进行克隆，获得麦角硫因合成途径中的基因，在鞘氨醇单胞菌hbj-193体内以pbbr1mcs-2为载体过表达部分基因，实现了麦角硫因产量的提升。

40、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

41、(1)本发明利用同源比对的方法找到鞘氨醇单胞菌hbj-193的麦角硫因合成酶基因，并提取鞘氨醇单胞菌hbj-193的dna后进行克隆获取。运用本地核酸库比对结果并结合pfam、nr数据库注释信息，拟定鞘氨醇单胞菌hbj-193的麦角硫因合成酶基因，通过swiss-model同源建模与耻垢分枝杆菌麦角硫因关键基因做对比可知，鞘氨醇单胞菌hbj-193的spegtb基因ge002087氨基酸序列与选择的同源建模模板相似度为52.66％；鞘氨醇单胞菌hbj-193的spegtd基因ge002086氨基酸序列与选择的同源建模模板相似度为40.72％；鞘氨醇单胞菌hbj-193的spegte基因ge001348氨基酸序列与选择的同源建模模板相似度为31.45％。

42、(2)本发明以鞘氨醇单胞菌hbj-193为原始菌株，以pbbr1mcs-2为载体过表达鞘氨醇单胞菌hbj-193麦角硫因合成基因，使得该菌株麦角硫因生产能力得到了提升，其产量可达73.46mg/l，较原始菌株麦角硫因产量增加44.63％，为麦角硫因的生产提供一条全新的生物合成途径，有望解决目前麦角硫因生产菌的缺点与不足。鞘氨醇单胞菌是普遍认为安全的菌株，，发酵周期短、发酵产物易于提取的特点，具有广阔的应用前景。