人子宫腺肌病异位上皮及间质细胞分离培养方法

本发明涉及人原代细胞分离培养领域，更具体地说，涉及一种子宫腺肌病病灶中异位上皮及间质细胞分离及培养的方法。

背景技术：

1、子宫腺肌病是一类妇科常见良性疾病，具体发病机制不明确，其痛经、月经量多、慢性盆腔痛及不孕等症状严重影响女性身心健康，子宫切除术为根治性治疗手段，随着人们生活水平和妇女自我意识提高，切除子宫越来越不被广大女性所接受，因其药物保守治疗难以根治、易复发性和患病趋向年轻化，同时生育需求增加子宫腺肌病也越来越受研究人员关注。有研究认为子宫腺肌病的发病是子宫内膜腺体及间质侵入子宫肌层所导致，子宫腺肌病在位内膜向子宫肌层黏附、侵袭、生长以及形成异位内膜是该病发生和发展的关键，综上所述，异位内膜上皮及间质细胞在子宫腺肌病的发生及发展中起着举足轻重的作用。同时因原代培养的细胞接近和反映体内生长的特性，现已广泛应用于各类实验研究中。所以分离和培养子宫腺肌病病灶中异位上皮和间质细胞显得尤为重要，迫在眉睫。

2、由于子宫腺肌病病灶的弥漫性和特殊性，对于子宫腺肌病病灶异位内膜上皮及间质的原代细胞培养困难，目前大部分研究都是建立在在位子宫内膜细胞基础上，至今无人成功高纯度把子宫腺肌病病灶中异位内膜细胞分离培养出来。有文献报道子宫腺肌病的原代细胞培养，但在取材过程中取整块病灶组织，培养出原代细胞不纯，含有平滑肌及肌纤维细胞，不能完全分离出上皮和间质细胞，另外上皮及间质细胞产量少，无法开展后续实验研究。所以，建立一种细胞纯度高、产量高、成功率高、操作简单的子宫腺肌病灶细胞的原代培养方法具有重要的意义。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种子宫腺肌病病灶异位内膜原代上皮及间质细胞分离和培养方法。

2、为实现上述技术目的，本发明的技术方案为：

3、本发明提供了人子宫腺肌病异位上皮及间质细胞分离培养方法，所述方法具体包括以下步骤：

4、s1：收集子宫腺肌病灶异位内膜组织置于无菌离心管中，无菌离心管内含有体积浓度为1％的双抗dmem/f12培养基；

5、s2：配置i型胶原酶：将i型胶原酶与无菌pbs混匀，i型胶原酶与无菌pbs的质量体积比为2mg：1ml；

6、s3：配置体积浓度为12％fbs的双抗dmem/f12完全培养基；

7、s4：处理标本：将子宫腺肌病灶异位内膜组织离心弃上清，转移至无菌培养皿中，剪碎组织，对剪碎后的组织再次进行离心并弃上清，收集离心后的沉淀物，以1:3体积比加入配置好的i型胶原酶重悬，通过摇床振荡消化，待组织块明显缩小或消失，且i型胶原酶液明显变浑浊加入等比例的12％fbs的双抗dmem/f12完全培养基；

8、s5：分离细胞：通过第一无菌细胞滤网过滤细胞悬液，去除组织残片，通过pbs冲洗滤网，离心弃上清，用dmem/f12完全培养基重悬细胞沉淀；通过第二无菌细胞滤网过滤细胞悬液，其中，第二无菌细胞滤网上层的细胞为上皮细胞，滤网下层的细胞为间质细胞；

9、s6：培养细胞：分别收集离心后的细胞，用体积浓度为12％的fbs的双抗dmem/f12完全培养基重悬，进行细胞培养，待细胞贴壁，其中，间质细胞24h后换液，上皮细胞48h后换液，获得子宫腺肌病灶异位上皮及间质细胞。

10、进一步地，所述子宫腺肌病灶异位内膜组织为生育期至未绝经期女性因子宫腺肌病行子宫全切及子宫腺肌病灶剔除术的子宫腺肌病灶异位内膜组织标本。

11、进一步地，所述步骤s4和步骤s5中的离心操作均采用离心转速为1000rpm，离心时间为5min。

12、进一步地，所述步骤s4中进行摇床振荡消化的过程包括：

13、采用37℃恒温摇床振荡消化45-60分钟，且摇床振荡消化半小时后每隔10min观察组织的消化程度。

14、进一步地，所述第一无菌细胞滤网为100μm无菌细胞滤网；所述第二无菌细胞滤网为第二无菌细胞滤网。

15、进一步地，所述步骤s6中进行细胞培养的过程包括：

16、12％fbs的双抗dmem/f12完全培养基的用量需覆盖培养器皿底部；将完全培养基置于37℃，5％的co2细胞培养箱中进行培养。

17、进一步地，所述分离培养方法还包括：

18、对获得的子宫腺肌病灶异位上皮及间质细胞进行流式细胞术进行细胞鉴定及细胞纯度分析；其中，流式细胞术中所用抗体为ep-cam(cd326)为上皮细胞表面标记物和cd10为间质细胞表面标记物。

19、本发明的有益之处在于：

20、(1)本发明的消化液采用胶原酶ⅰ和37℃恒温摇床，使得消化过程更加温和和透彻，消化后的细胞及组织活性更高，易于贴壁；通过用100μm和40μm孔径的无菌细胞过滤筛过滤对细胞进行分离和纯化，细胞分离后纯度较高，易于操作，成本低。

21、(2)培养基的用量为覆盖培养器皿底部为宜，均可促进细胞贴壁，提高细胞产量。采用的试剂添加1％的青/链霉素，能够防止样本本身或采集运输中及分离培养过程中的污染。

22、(3)本发明采用胶原酶消化法对其病灶中异位内膜组织进行了原代分离和培养，可操作性强，培养成功率高，纯度高，该培养方法在子宫腺肌病的研究和临床诊断治疗领域具有广泛的应用前景。

技术特征：

1.人子宫腺肌病异位上皮及间质细胞分离培养方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的人子宫腺肌病异位上皮及间质细胞分离培养方法，其特征在于，所述子宫腺肌病灶异位内膜组织为生育期至未绝经期女性因子宫腺肌病行子宫全切及子宫腺肌病灶剔除术的子宫腺肌病灶异位内膜组织标本。

3.根据权利要求1所述的人子宫腺肌病异位上皮及间质细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤s4和步骤s5中的离心操作均采用离心转速为1000rpm，离心时间为5min。

4.根据权利要求1所述的人子宫腺肌病异位上皮及间质细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤s4中进行摇床振荡消化的过程包括：

5.根据权利要求1所述的人子宫腺肌病异位上皮及间质细胞分离培养方法，其特征在于，所述第一无菌细胞滤网为100μm无菌细胞滤网；所述第二无菌细胞滤网为40μm无菌细胞滤网。

6.根据权利要求1所述的人子宫腺肌病异位上皮及间质细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤s6中进行细胞培养的过程包括：

7.根据权利要求6所述的人子宫腺肌病异位上皮及间质细胞分离培养方法，其特征在于，所述步骤s6中进行细胞培养的过程包括：

8.根据权利要求1所述的人子宫腺肌病异位上皮及间质细胞分离培养方法，其特征在于，所述分离培养方法还包括：

技术总结
本发明公开了一种人子宫腺肌病异位上皮及间质细胞分离培养方法，包括：收集子宫腺肌病灶异位内膜组织，配置I型胶原酶；配置12％FBS的双抗DMEM/F12完全培养基；将子宫腺肌病灶异位内膜组织离心弃上清，剪碎组织，再次离心并弃上清，收集沉淀物，加入配置好的I型胶原酶重悬，通过摇床振荡消化，待组织块明显缩小或消失，且I型胶原酶液明显变浑浊加入12％FBS的双抗DMEM/F12完全培养基；通过第一无菌细胞滤网过滤，PBS冲洗滤网，离心弃上清，用DMEM/F12完全培养基重悬细胞沉淀；通过第二无菌细胞滤网过滤细胞悬液，滤网上层为上皮细胞，滤网下层为间质细胞；分别收集离心后的细胞，用12％的FBS的双抗DMEM/F12完全培养基重悬，进行细胞培养，获得子宫腺肌病灶异位上皮及间质细胞。

技术研发人员：张信美,方舟,王建章,李田田
受保护的技术使用者：浙江大学医学院附属妇产科医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13