一种黄曲霉毒素B1荧光适体传感器及检测方法和试剂盒

本发明属于毒素检测领域，具体地，涉及一种黄曲霉毒素b1荧光适体传感器、一种基于无标记靶标抑制的黄曲霉毒素b1检测方法以及一种黄曲霉毒素b1荧光检测试剂盒。

背景技术：

1、黄曲霉毒素(afs)是一种有毒的致突变和致癌物质，是双呋喃类的代谢物，目前已鉴定的afs种类近20种。其中，黄曲霉毒素b1(afb1)毒性最大，对温度和湿度的抗性更强。此外，afb1对人和动物具有高度的肝毒性和胚胎毒性。国际癌症研究机构已确认afb1为剧毒代表，并将其指定为i类致癌物质。afb1广泛存在于各种食品和饲料产品中。因此，探索一种现场、精确、超敏的afb1定量分析方法迫在眉睫。

2、afb1的检测一直采用传统的色谱检测方法，包括高效液相色谱和液相色谱-质谱。虽然基于色谱的方法具有较高的检测精度和灵敏度，但它们总是需要昂贵的设备，冗长的分析时间和费力的步骤。另外，使用抗体作为亲和配体的基于免疫分析的方法是更容易使用的afb1检测方法，在速度、简单性和便携性方面具有优势。然而，它们可能会受到抗体制备复杂和成本高的影响，尤其是针对afb1。

3、适配体是由一种称为指数富集配体系统进化的体外筛选方法选择的单链寡核苷酸(ssdna或rna)，形成折叠良好的三级结构，可以特异性识别目标对象。适配体作为一种具有高亲和性、特异性和良好热稳定性的新型识别元件，被认为是afb1检测方法建立中较好的抗体替代品。研究人员设计了多种基于适体的afb1检测方法，如荧光、比色或电化学适体传感器。其中，荧光适配体传感器因其操作简单、灵敏度高、在复杂食物基质中具有良好的稳定性而备受关注。然而，目前报道的许多检测方法仍存在一些缺陷，包括荧光团的化学标记复杂、信号产生步骤多或样品检测孵育时间长。为了克服这些缺点，基于适配体的无标签dna扩增策略发展出来，如杂交链式反应(hcr)、聚合酶链式反应(pcr)、链置换扩增(sda)、解旋酶依赖扩增(hda)和滚环扩增(rca)。在这些方法中，rca因其温和的等温酶促反应和高效率，可以产生相当长的串联序列来实现信号放大而受到越来越多的关注。rca操作简单，只需要一个短的线性dna作为启动子，环形dna作为模板，phi29 dna聚合酶(phi 29dp)即可进行扩增。因此，许多研究使用rca技术作为信号放大器，建立了针对不同目标物体的超灵敏检测系统。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于afb1适体与等温扩增反应联合的简化荧光适体传感器，可以在不使用任何标记或修饰dna探针的情况下超灵敏和选择性地检测afb1。

2、本发明的第一方面提供一种黄曲霉毒素b1荧光适体传感器，所述荧光适体传感器为seq id no：1所示的如下核苷酸序列：

3、5’-gttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggcccacatagtcgagatat-3’。

4、本发明以afb1适体和引物区组成的双功能探针作为识别元件。当探针暴露于afb1时，由于afb1-探针复合物形成，探针优先与afb1结合，而不是与环状模板结合，从而抑制了rca过程的启动。因此，可以监测荧光信号的显著下降，从而实现对复杂食品基质中afb1的快速、无标记、高灵敏度和选择性测试。

5、基于上述原理，本发明的第二方面提供一种基于无标记靶标抑制的黄曲霉毒素b1检测方法，包括以下步骤：

6、(1)将权利要求1所述的荧光适体传感器、rca环状模板、结合缓冲液和含有黄曲霉毒素b1的样品溶液混合，室温孵育；

7、(2)加入dntp、rca反应缓冲液和phi29 dna聚合酶，所得混合物孵育后进行加热反应，然后将反应混合物、结合缓冲液和荧光染料混合，进行荧光强度测定，对样品中黄曲霉毒素b1进行定性和/或定量检测。

8、根据本发明一种优选实施方式，所述rca环状模板的序列如下所示：

9、5’-tcggatatctcgactagtcaagaccctaaccctaaccctaaccctacaacatgtctttga-3’，seq id no：2。

10、根据本发明一种优选实施方式，步骤(1)体系中，荧光适体传感器的浓度为70-90nm，rca环状模板的浓度为40-60nm。

11、根据本发明一种优选实施方式，步骤(1)中，室温孵育的时间为25-35min。

12、根据本发明一种优选实施方式，步骤(2)中，孵育的温度为28-32℃，时间为55-65min，加热反应的温度为60-70℃，时间为10-20min。

13、根据本发明一种优选实施方式，所述荧光染料为sybrtm gold，加入荧光染料后在30min内进行荧光强度测定。

14、根据本发明一种优选实施方式，所述荧光强度测定的条件为λex＝498nm，λem＝540nm。

15、根据本发明一种优选实施方式，所述方法还包括制作黄曲霉毒素b1的标准曲线，根据标准曲线计算样品中黄曲霉毒素b1的含量。

16、本发明的第三方面提供一种黄曲霉毒素b1荧光检测试剂盒，包括以下组分：

17、(1)上述的荧光适体传感器，序列如seq id no：1所示；

18、(2)rca环状模板，序列如seq id no：2所示；

19、(3)结合缓冲液；

20、(4)dntp；

21、(5)rca反应缓冲液及phi29 dna聚合酶；

22、(6)荧光染料。

23、本发明设计了以afb1适体和引物区组成的双功能探针，作为afb1荧光适体传感器，并基于此提供了一种afb1荧光检测方法，能够实现对复杂食品基质中的afb1进行快速、无标记、高灵敏度和特异性的检测。

24、本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

技术特征：

1.一种黄曲霉毒素b1荧光适体传感器，其特征在于，所述荧光适体传感器为seq id no：1所示的如下核苷酸序列：

2.一种基于无标记靶标抑制的黄曲霉毒素b1检测方法，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的检测方法，其中，所述rca环状模板的序列如下所示：

4.根据权利要求2所述的检测方法，其中，步骤(1)体系中，荧光适体传感器的终浓度为70-90nm，rca环状模板的终浓度为40-60nm。

5.根据权利要求2所述的检测方法，其中，步骤(1)中，室温孵育的时间为25-35min。

6.根据权利要求2所述的检测方法，其中，步骤(2)中，孵育的温度为28-32℃，时间为55-65min，加热反应的温度为60-70℃，时间为10-20min。

7.根据权利要求2所述的检测方法，其中，所述荧光染料为sybrtmgold，加入荧光染料后在30min内进行荧光强度测定。

8.根据权利要求2所述的检测方法，其中，所述荧光强度测定的条件为λex＝498nm，λem＝540nm。

9.根据权利要求2所述的检测方法，其中，所述方法还包括制作黄曲霉毒素b1的标准曲线，根据标准曲线计算样品中黄曲霉毒素b1的含量。

10.一种黄曲霉毒素b1荧光检测试剂盒，包括以下组分：

技术总结
本发明属于毒素检测领域，涉及一种黄曲霉毒素B<subgt;1</subgt;荧光适体传感器及检测方法和试剂盒。所述荧光适体传感器为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。所述检测方法包括以下步骤：(1)将荧光适体传感器、RCA环状模板、结合缓冲液和含有黄曲霉毒素B<subgt;1</subgt;的样品溶液混合，室温孵育；(2)加入dNTP、RCA反应缓冲液和phi29DNA聚合酶，所得混合物孵育后进行加热反应，然后将反应混合物、结合缓冲液和荧光染料混合，进行荧光强度测定，对样品中黄曲霉毒素B<subgt;1</subgt;进行定性和/或定量检测。本发明的AFB<subgt;1</subgt;荧光检测方法能够实现对复杂食品基质中的AFB<subgt;1</subgt;进行快速、无标记、高灵敏度和特异性的检测。

技术研发人员：郑磊,毛瑜,刘长虹,姚丽丽
受保护的技术使用者：合肥工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12