一种基于蛋白多聚体的间充质干细胞工程化改造方法及其应用

本发明属生物，具体涉及一种基于蛋白多聚体的间充质干细胞工程化改造方法及其应用。

背景技术：

1、间充质干细胞，泛指一类具有一定分化潜能、可以分化成多种细胞类型、具有组织修复功能的多能基质细胞群，因其修复受损组织、抑制炎症反应以及免疫调节等特性，已成为再生医学领域的研究热点。间充质干细胞由于其构成型主要组织相容性复合体mhc1的低表达，mhc2和共刺激分子如cd80、cd86和cd40的缺失，使它们具有弱免疫原性。移植的间充质干细胞表现出良好的治疗特性，首先这些细胞具有多向分化潜能以及产生特定的细胞外基质，可在不同诱导条件下分化为软骨、骨，脂肪细胞等；此外间充质干细胞还能通过旁分泌的方式改善损伤组织内部的微环境，发挥其治疗功能。间充质干细胞在心血管疾病、退行性疾病、骨损伤等重大疾病的治疗上显示出极高的应用前景和价值。

2、截止到2022年8月，clinical trials网站收录的间充质干细胞临床研究全球已超过1300项。目前，间充质干细胞治疗面临的一个主要挑战是有效地将细胞传递到受损的组织中。局部注射到组织或输注到近端血管是两种潜在的输送途径。对于血管损伤，局部注射是危险的，因为动脉壁很薄而且有搏动。而血管内输注是微创的，可以重复给药，并避免了与继发性血管损伤和钙化相关的问题。然而在临床研究中发现，间充质干细胞通过血管输注后，最终成功粘附于损伤组织的移植细胞比例通常低于1％，低粘附效率严重制约了间充质干细胞的临床疗效。研究表明，间充质干细胞到达损伤组织周围的血管时，通过细胞表面的粘附分子与血管内皮细胞表达的受体之间的相互作用而黏附于血管内皮细胞层，进而跨内皮层迁移、定植于损伤组织。然而，不同来源的间充质干细胞表面的粘附分子表达不均一，此外，间充质干细胞在体外培养扩增的过程中也会丢失这些关键的与粘附相关的细胞表面生物分子，从而导致间充质干细胞粘附和定植效率低。因此，如何提高间充质干细胞在损伤组织的粘附效率成为临床研究亟需解决的关键问题。

3、细胞表面包含各种生物分子，它们识别环境的能力对细胞的功能很重要。许多细胞表面修饰的方法已经被研究，用外源性生物分子来功能化活细胞，以实现新的分子识别功能。功能化细胞已被广泛研究应用于免疫治疗、组织工程和干细胞归巢等领域。近年来，通过非基因工程技术进行间充质干细胞的改造受到越来越多的关注。许多报道表明，通过非基因工程技术，利用与病理标记物具有高亲和力的生物活性分子在间充质细胞表面进行修饰，可以提高血管内传递的间充质细胞对目标组织粘附的效率，并有利于组织修复。研究人员陆续探索了使用酶促转化、共价键合、疏水嵌插等手段将黏附分子修饰于间充质干细胞细胞表面。当对细胞表面进行修饰时，重要的是要确保细胞的原始成分和功能不会受到明显的改变或干扰。因此，将数量最少的外源生物分子直接修饰在细胞表面，同时实现所需的分子识别功能是十分有意义的。现有的技术方法功能化间充质干细胞都是单分子功能化的，即在细胞表面的每个点上显示单个生物分子。这些技术虽然成果显著，但仍然存在很大的局限性。细胞粘附是通过多价相互作用实现的，然而已报道的研究是在间充质干细胞膜上修饰粘附分子单体，受限于单价作用的低亲和力，改造后的间充质干细胞粘附附能力提升有限。

技术实现思路

1、本发明第一方面的目的，在于提供一种蛋白单体。

2、本发明第二方面的目的，在于提供一种试剂盒。

3、本发明第三方面的目的，在于提供一种蛋白多聚体。

4、本发明第四方面的目的，在于提供本发明第一方面的蛋白单体、本发明第二方面的试剂盒或本发明第三方面的蛋白多聚体在细胞工程化改造中的应用。

5、本发明第五方面的目的，在于提供一种工程化改造的细胞。

6、本发明第六方面的目的，在于提供一种细胞工程化改造方法。

7、本发明第七方面的目的，在于提供本发明第四方面的细胞或本发明第五方面的工程化改造方法在制备产品中的应用。

8、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

9、本发明的第一个方面，提供一种蛋白单体，包括：

10、a)dna单体1和蛋白；或

11、b)dna单体2和蛋白；

12、所述dna单体1的核苷酸序列如seq no id:1所示，所述dna单体2的核苷酸序列如seq no id:2所示。

13、优选地，所述dna单体1的核苷酸序列的3’端连接一个nh2 c6基团。

14、优选地，所述dna单体2的核苷酸序列的5’端连接一个nh2 c6基团。

15、优选地，所述蛋白为特异性粘附在目标蛋白上的分子/蛋白；进一步所述蛋白是特异性结合目的抗原的蛋白；更进一步所述蛋白为抗体；最优为anti-vcam1抗体。

16、优选地，所述蛋白单体的制备方法包括以下步骤：

17、dna单体与交联剂连接：dna单体、交联剂和dmso混合，反应，得到dna单体-交联剂；

18、蛋白与交联剂连接：蛋白与交联剂混合，反应，得到蛋白-交联剂；

19、将dna单体-交联剂和蛋白-交联剂混合，加入催化剂，反应，得到蛋白单体。

20、优选地，所述dna单体与交联剂连接中所述的交联剂包括s-4fb、sm(peg)2(赛默飞，cas:22102)和nhs-peg-dbco ester(康福诺，cas:1427004-19-0)中的至少一种。

21、优选地，所述dna单体与交联剂连接中所述的反应的条件为20～38℃震荡反应1～3h；进一步为24～27℃震荡反应1～2h；更进一步为25℃震荡反应2h。

22、优选地，所述dna单体的nh2c6基团与4-fb连接。

23、优选地，所述蛋白与交联剂连接中所述的交联剂包括s-hynic，nhs-peg-azide(赛默飞，cas：26130)。

24、优选地，所述蛋白与交联剂混合前进行蛋白脱盐处理。

25、优选地，所述交联剂与蛋白混合前用dmso溶解。

26、优选地，所述蛋白与交联剂连接中所述的反应的条件为20～38℃震荡反应1～3h；进一步为24～27℃震荡反应1～2h；更进一步为25℃震荡反应2h。

27、优选地，所述dna单体-交联剂和蛋白-交联剂混合后的反应的条件为20～38℃震荡反应1～3h；进一步为24～27℃震荡反应1～2h；更进一步为25℃震荡反应2h。

28、本发明的第二个方面，提供一种试剂盒，所述试剂包含本发明第一方面的蛋白单体。

29、优选地，所述试剂盒还包括引发剂。

30、优选地，所述引发剂的核苷酸序列如seq id no:3所示。

31、优选地，所述引发剂的核苷酸序列的3’端连接一个胆固醇基团。

32、本发明的第三个方面，提供一种蛋白多聚体，包括本发明第一方面的蛋白单体。

33、优选地，所述蛋白多聚体包括本发明第一方面的蛋白单体中的a)和b)两种蛋白单体。

34、优选地，所述蛋白多聚体的制备方法包括以下步骤：将a)和b)两种蛋白单体与引发剂混合，反应，即得到蛋白多聚体。

35、优选地，所述引发剂的终浓度为0.05～2μm；进一步为0.05～1μm；更进一步为0.08～1μm。

36、本发明的第四个方面，提供本发明第一方面的蛋白单体、本发明第二方面的试剂盒或本发明第三方面的蛋白多聚体在细胞工程化改造中的应用。

37、优选地，所述细胞包括干细胞；进一步包括间充质干细胞。

38、本发明的第五个方面，提供一种细胞工程化改造后的细胞，所述细胞的表明修饰有本发明第一方面的蛋白单体或本发明第三方面的蛋白多聚体。

39、优选地，所述细胞包括干细胞；进一步包括间充质干细胞。

40、本发明的第六个方面，提供一种细胞工程化改造方法，包括以下步骤：

41、(1)将待改造的细胞与本发明第二方面中的引发剂混合，反应；

42、(2)将步骤(1)反应后的混合物与本发明第一方面的蛋白单体混合，反应，即得到工程化改造后的细胞。

43、优选地，所述引发剂的核苷酸序列如seq id no:3所示。

44、优选地，所述引发剂的核苷酸序列的3’端连接一个胆固醇基团。

45、优选地，所述引发剂的终浓度为0.05～3μm；进一步为0.05～2μm；更进一步为0.05～1μm。

46、优选地，步骤(1)中所述反应的条件为20～37℃震荡反应15～30min；进一步为20～25℃震荡反应20～30min；更进一步为25℃震荡反应20min。

47、优选地，步骤(2)中所述的反应的条件为20～37℃震荡反应2～4h；进一步为20～25℃震荡反应2～3h；更进一步为25℃震荡反应3h。

48、优选地，所述细胞包括干细胞；进一步包括间充质干细胞。

49、本发明的第七个方面，提供本发明第四方面的细胞或本发明第五方面的细胞工程化改造方法在制备组织修复和/或增强细胞对受损组织粘附能力的产品中的应用中的应用。

50、优选地，所述组织包括血管。

51、本发明的有益效果是：

52、本发明提供的蛋白单体是借助dna的可编程性设计出符合要求的dna序列，并通过dna与蛋白连接得到。通过将该蛋白单体修饰在细胞表面，可提高细胞对损伤组织的粘附作用，促进组织的修复。

53、本发明提供的蛋白多聚体是在将蛋白单体在人为可控的条件下加入dna引发剂发生杂交链式反应形成蛋白多聚体，将该蛋白多聚体应用于间充质干细胞的改造中，可极大的增强间充质干细胞对受损组织部位血管的粘附能力。

54、本发明提供的细胞中，在细胞表面修饰形成粘附蛋白多聚体，对细胞进行多价功能化，通过多价作用的高亲和力，极大的增强该细胞对损伤组织部位血管的粘附能力，且不会影响细胞的增殖速率与分泌细胞因子的功能。

55、本发明提出的间充质干细胞工程化改造方法，只需要提前将dna单体与粘附蛋白连接，第一步在细胞悬液中加入dna引发剂，dna引发剂通过疏水嵌插的方式连接在间充质干细胞表面，然后第二步加入提前连接好的蛋白单体(dm1-antivcam1，dm2-antivcam1)，利用dna杂交链式反应将互补的dna自组装在间充质干细胞表面从而引导蛋白多聚体的形成，整个工程化改造过程在pbs溶液中几个小时就可以完成，改造方法简单高效，对细胞的影响极其微小。工程化改造后通过蛋白多聚体与血管上皮细胞的多价作用所提供的高亲和力极大地增强间充质干细胞对血管上皮细胞的粘附能力，从而增强间充质干细胞在组织修复中的治疗作用。细胞表面构建多聚体分子的技术为增强间充质干细胞的靶向粘附能力提供了新的解决思路。