一种用于生产GDP-L-岩藻糖的基因工程菌及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种用于生产gdp-l-岩藻糖的基因工程菌。

背景技术：

1、母乳含有大量由乳糖、d-葡萄糖、d-半乳糖、乙酰葡萄糖胺、l-岩藻糖和唾液酸组成的母乳低聚糖，是母乳中第三丰富的固体组分。母乳低聚糖的功能涉及广泛的生物学过程，比如可以预防病原体感染、改善免疫系统反应、减少炎症进程等，在婴幼儿的成长发育中起着重要的作用。在母乳低聚糖中，岩藻糖基化低聚糖的含量是最高的。尽管岩藻糖基化低聚糖的化学合成早已实现，但该方法非常昂贵和费力，伴随着多重保护和脱保护步骤，这种复杂性使其无法适用于工业生产。相比而言，生物合成通过糖基转移酶的特异性提供了更高的效率。岩藻糖基化低聚糖的生产需要gdp-l-岩藻糖作为供体，因此gdp-l-岩藻糖的体内积累是岩藻糖基化低聚糖大规模生产的限制因素。

2、gdp-l-岩藻糖在胞质内有两种合成途径，分别为从头合成途径以及补救途径。从头合成途径存在于原核生物和真核生物中，利用甘油、葡萄糖、蔗糖等通过体内代谢途径形成果糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸通过甘露糖-6-磷酸异构酶和磷酸甘露糖变位酶形成甘露糖-1-磷酸。甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶催化从gtp到甘露糖-1-磷酸的核苷酸转移产生了gdp-甘露糖，然后将其分别由gdp-甘露糖-4,6-脱氢酶和nadph依赖性gdp-l-岩藻糖合酶催化分成两部转化为gdp-l-岩藻糖。补救途径利用游离在胞质的、来源于细胞外或溶酶体降解物的l-岩藻糖作为底物l-岩藻糖首先被岩藻糖激酶磷酸化，形成岩藻糖-1-磷酸，然后被gdp-岩藻糖焦磷酸化酶转化为gdp-l-岩藻糖。

3、目前，已有多种用于gdp-l-岩藻糖的生物合成的工程菌株被开发。有文献报导，可以通过在谷氨酸棒状杆菌内共表达涉及从头途径的四种酶从而实现gdp-l-岩藻糖的生物合成。lee等人优化了工程大肠杆菌的从头途径来增加gdp-l-岩藻糖的产量。通过优化碳源、过量表达关键酶、加强辅因子nadph或gtp的再生、调节分批补料发酵模式、在大肠杆菌中过表达内源gdp-l-岩藻糖从头合成通路同时强化辅因子nadph的循环再生，gdp-l-岩藻糖的产量能够达到235.2mg/l。然而，现有技术中所使用的甘露糖-6-磷酸异构酶(mana)、磷酸甘露糖变位酶(manb)、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶(manc)、gdp-甘露糖-4,6-脱氢酶(gmd)、gdp-l-岩藻糖合成酶(fcl)一般来源于大肠杆菌，来源单一且产量较低，无法达到工业化大规模生产的要求。因此，迫切需要一种高产的gdp-l-岩藻糖的生物合成方式。

技术实现思路

1、发明要解决的问题

2、为了解决现有技术的上述问题，本发明提供了一种高产的用于生产gdp-l-岩藻糖的基因工程菌及其应用。所述基因工程菌表达来源于柠檬酸杆菌属(citrobacter)的甘露糖-6-磷酸异构酶(mana)、磷酸甘露糖变位酶(manb)、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶(manc)、gdp-甘露糖-4,6-脱氢酶(gmd)、gdp-l-岩藻糖合成酶(fcl)。

3、用于解决问题的方案

4、本发明提供了一种用于生产gdp-l-岩藻糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌在本底菌株上表达了来源于柠檬酸杆菌(citrobacter)的甘露糖-6-磷酸异构酶(mana)、磷酸甘露糖变位酶(manb)、甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶(manc)、gdp-甘露糖-4,6-脱氢酶(gmd)和gdp-岩藻糖合成酶(fcl)。

5、优选地，所述本底菌株为大肠杆菌jm109、大肠杆菌bl21(de3)、大肠杆菌nissle、大肠杆菌k-12、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌或柠檬酸杆菌中的一种。

6、优选地，所述本底菌株为大肠杆菌bl21(de3)。

7、优选地，所述柠檬酸杆菌为杨氏柠檬酸杆菌(citrobacter youngae)、弗氏柠檬酸杆菌(citrobacter freundii)、布氏柠檬酸杆菌(citrobacter braakii)或克氏柠檬酸杆菌(citrobacter koseri)中的一种。

8、优选地，所述柠檬酸杆菌为杨氏柠檬酸杆菌(citrobacter youngae)atcc 29935。

9、优选地，所述来源于柠檬酸杆菌的甘露糖-6-磷酸异构酶(mana)的核苷酸序列与seq idno.1相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，优选为seq id no.1。

10、优选地，所述来源于柠檬酸杆菌的磷酸甘露糖变位酶基因(manb)的核苷酸序列与seq id no.2相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，优选为seq id no.2。

11、优选地，所述来源于柠檬酸杆菌的甘露糖-1-磷酸鸟嘌呤基转移酶基因(manc)的核苷酸序列与seq id no.3相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，优选为seq id no.3。

12、优选地，所述来源于柠檬酸杆菌的gdp-甘露糖-4,6-脱氢酶基因(gmd)的核苷酸序列与seq id no.4相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，优选为seq id no.4。

13、优选地，所述来源于柠檬酸杆菌的gdp-岩藻糖合成酶基因(fcl)的核苷酸序列与seq idno.5相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，优选为seq id no.5。

14、优选地，所述基因工程菌在本底菌株上敲除了udp-葡萄糖脂质载体转移酶(wcaj)基因。

15、本发明还提供了一种所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将mana、manb、manc、gmd和fcl基因串联后插入到质粒的多克隆位点进行表达。

16、本发明还提供了一种所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法包括步骤：将mana、manb、manc、gmd和fcl基因通过不同的组合整合到基因组特殊位点进行表达。

17、优选地，所述不同的组合为通过随机组合串联。

18、优选地，所述基因组特殊位点是gmm-wcai、wcaj-wzxc、wcak-wcam、yjip-yjir、thrw-ykfn、ykgh-beta、iley-ygaq、ypjc-iley、dadx-cvra中的一个或多个。

19、优选地，所述基因串联后，在上游增加启动子和rbs，在下游增加终止子。

20、优选地，所述启动子是t7、lac、tac、trp、j23119中的一个，所述rbs是bba_b0034、bba_b0032、bba_b0030、bba_b0029中的一个。

21、本发明还提供了一种所述基因工程菌或根据本发明所述方法制备得到的基因工程菌在生产gdp-l-岩藻糖中的应用。

22、发明的效果

23、本发明所使用的甘露糖-6-磷酸异构酶(mana)、磷酸甘露糖变位酶(manb)、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶(manc)、gdp-甘露糖-4,6-脱氢酶(gmd)、gdp-l-岩藻糖合成酶(fcl)基因来源于柠檬酸杆菌，本发明的基因工程菌能够提高gdp-l-岩藻糖的产量。