一种多聚磷酸盐依赖型激酶的突变体蛋白及其应用

本发明属于基因重组，涉及一种多聚磷酸盐依赖型激酶的突变体蛋白及其应用。

背景技术：

1、甘露糖-6-磷酸(m6p)的分子式为c6h13o9p，在人体细胞内参与了很多代谢途径，如糖异生、脂肪细胞的分化等。分泌蛋白在内质网折叠后，运送到高尔基体中，在最终糖基化修饰蛋白时，m6p参与末端修饰和糖蛋白标记；也可以参与细胞内溶酶体酶的标记，正因如此，它与人体的一些疾病有着间接关系。最近的文献报道提出甘露糖-6-磷酸与胰腺炎的发病有关，m6p通路可以维持胰腺外分泌平衡和功能，而m6p通路的阻断会导致溶酶体自噬途径的紊乱，进而导致胰腺炎的发病。

2、m6p作为一种与生物体内环境密切相关的物质，可以利用其参与反应的多样性，对m6p的应用进行开发，如磷酸甘露糖异构酶(pmi)作为一种可以催化m6p异构为果糖-6-磷酸(f6p)的酶，可以作为筛选体系正筛选植物转化细胞是否成功。在医疗应用上，目前人们已经利用m6p可以标记溶酶体酶的特征来进行靶向药物输送来治疗肿瘤。m6p与甘露糖-6-磷酸受体(m6pr)的特异性结合对细胞信号传导的影响可以被用在很多疾病的治疗上，比如肿瘤、水痘和带状疱疹病毒、粘多糖病等等。m6p也可以与胰岛素生长因子ii受体(igf2r)结合，应用在畜牧业中治疗猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,ped)，也可以应用在免疫化疗中。m6pr已经被证明与很多肿瘤细胞都有关，根据此原理可以利用甘露糖对肿瘤进行治疗。近年来m6p在美容领域也受到了重视，如改善皮肤的生物力学性能，从而达到抗衰老的目的及治疗皮肤发红等。如今对甘露糖-6-磷酸的应用研究仍是热点，它在生物体内参与的众多过程，更是使它在医疗上的应用十分广泛。

3、通过化学法合成m6p是低效且复杂的，传统生产工艺要先通过费歇尔糖苷化、再通过一系列的酯化反应、水解、浓缩、柱层析，最后用swern氧化反应以及苄基保护反应，才能达到70％左右的收率。本课题组已经用来源于节杆菌(arthrobacter.sp)km菌株的l7基因(genebank登录号ab096174)异源表达了一种多聚磷酸盐依赖型激酶(ppgmk)，用六偏磷酸钠来代替价格高昂的atp，低价绿色高效地合成m6p，在该研究中，12h反应后，甘露糖转化为m6p的转化率接近100％，反应在30℃下进行，无副产物，是一种绿色的生产工艺。但由于ppgmk的热稳定性很低，在50℃下40min就会失活，因此，目前亟需提高ppgmk的热稳定性。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的问题，提供一种多聚磷酸盐依赖型激酶的突变体蛋白，比野生型多聚磷酸盐依赖型激酶有着更高的热稳定性和酶活力。

2、为此，本发明第一方面提供了一种影响多聚磷酸盐依赖型激酶的热稳定性和酶活力的氨基酸突变子，其包括位于原多聚磷酸盐依赖型激酶(ppgmk)的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第187位ala突变为arg和/或第166位asn突变为ser。

3、本发明第二方面提供了一种多聚磷酸盐依赖型激酶的突变体蛋白，其序列包含位于原多聚磷酸盐依赖型激酶(ppgmk)的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第187位ala突变为arg和/或第166位asn突变为ser。

4、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为1号ppgmk突变体蛋白，其序列中包含位于原多聚磷酸盐依赖型激酶(ppgmk)的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第187位ala突变为arg；优选地，所述1号ppgmk突变体蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。

5、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为2号ppgmk突变体蛋白，其序列中包含位于原多聚磷酸盐依赖型激酶(ppgmk)的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第166位asn突变为ser；优选地，所述2号ppgmk突变体蛋白的序列如seq id no.3所示。

6、在本发明的一些实施例中，所述突变体蛋白为3号ppgmk突变体蛋白，其序列中包含位于原多聚磷酸盐依赖型激酶(ppgmk)的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第187位ala突变为arg和位于原多聚磷酸盐依赖型激酶(ppgmk)的如seq id no.1所示的氨基酸序列从n端到c端的第166位asn突变为ser；优选地，所述3号ppgmk突变体蛋白的序列如seq id no.4所示。

7、根据本发明，所述突变体蛋白还包括上多聚磷酸盐依赖型激酶的突变体蛋白的n端或c端连接标签得到的融合蛋白；优选地，所述标签包括his标签和/或sumo标签；进一步优选地，所述突变体蛋白还包括由1号ppgmk突变体蛋白、2号ppgmk突变体蛋白或3号ppgmk突变体蛋白的n端或c端连接his标签或sumo标签得到的融合蛋白。

8、本发明第三方面提供了一种影响多聚磷酸盐依赖型激酶酶活力的核苷酸突变子，其包括位于编码原ppgmk的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.5所示的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第496位a突变为t、第497位a突变为c、第498位t突变为c、第560位t突变为g、第561位c突变为t中的一个或几个。

9、本发明第四方面提供了一种编码本发明第二方面所述的突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码原ppgmk的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq id no.5所示的核苷酸序列中的从5′端到3′端方向的第496位a突变为t、第497位a突变为c、第498位t突变为c、第560位t突变为g、第561位c突变为t中的一个或几个。

10、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码1号ppgmk突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码原ppgmk的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq idno.5所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第560位t突变为g、第561位c突变为t；优选地，所述编码ppgmk突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.6所示；

11、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码2号ppgmk突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码原ppgmk的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq idno.5所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第496位a突变为t、第497位a突变为c、第498位t突变为c；优选地，所述编码ppgmk突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq idno.7所示；

12、在本发明的一些实施例中，所述核苷酸分子为编码3号ppgmk突变体蛋白的核苷酸分子，其序列中包含位于编码原ppgmk的如seq id no.1所示的氨基酸序列的如seq idno.5所述的核苷酸序列的从5′端到3′端方向的第496位a突变为t、第497位a突变为c、第498位t突变为c、第560突变为t与g、第561位c突变为t；优选地，所述编码ppgmk突变体蛋白的核苷酸分子的核苷酸序列如seq id no.8所示。

13、根据本发明，所述核苷酸分子为如下dna分子：

14、(a1)编码区包括如seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8所示的核苷酸序列的dna分子；

15、(a2)核苷酸序列如seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8所示的核苷酸序列的dna分子；

16、(a3)与(a1)或(a2)中所述的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码本发明第二方面中的所述的蛋白质的dna分子；

17、(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)中所述的核苷酸序列杂交，且编码本发明第二方面中的所述的蛋白质的dna分子。

18、本发明第五方面提供了一种含有本发明第四方面所述的核苷酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

19、本发明第五方面提供了如本发明第二方面所述的突变体蛋白或由如本发明第四方面所述的核苷酸分子或如本发明第五方面所述的表达盒、重组载体或重组微生物制得的突变体蛋白在催化甘露糖合成甘露糖-6-磷酸中的应用。

20、在本发明的一些实施例中，所述应用包括催化甘露糖合成甘露糖-6-磷酸、提高催化甘露糖合成甘露糖-6-磷酸产量和提高ppgmk的热稳定性和酶活力。

21、本发明的优点在于：

22、(1)本发明所提供的热稳定的多聚磷酸盐依赖型激酶(ppgmk)比野生型有着更高的热稳定性和酶活，本发明筛选出的关于ppgmk的突变位点n166s和a187r是未曾报道过的突变位点。

23、(2)本发明使用的高通量筛选方法可以快速检测残余葡萄糖含量，并结合高通量移液站，将其应用在了高通量筛选突变体文库上，高效快速地筛选出了热稳定性提升的突变位点。

24、(3)本发明结合模拟计算筛选出了其中一个位点n166，突变后发现其对热稳定性有很大贡献，将其与随机突变筛选出的位点a187r结合到一起，使多聚磷酸盐依赖型激酶(ppgmk)的热稳定性和酶活都得到了更高的提升。