本发明属于禽蛋高值化加工及品质提升，公开了一种将伴刀豆球蛋白a功能化修饰的磁性纳米颗粒应用于鸡蛋蛋清中卵转铁蛋白分离提取的高效方案。
背景技术：
1、鸡蛋蛋清中含有丰富的优质蛋白质。蛋白质是生命活动的物质基础，它是生物体内的功能性高分子，几乎在所有的生命活动中都发挥着重要作用。作为一种具有高营养价值、高加工适用性、易吸收的食品主要营养组分，蛋白质广泛应用于各类食品中。鸡蛋蛋清中富含多种蛋白质，包括卵清蛋白(54％)、卵转铁蛋白(12％)、卵粘蛋白(11％)、g2和g3球蛋白(各4％)、卵类黏蛋白(3.5％)和溶菌酶(3.4％)。这些蛋白质不仅可以用于食品工业，而且在化妆品、医药和营养方面也有广阔的应用前景。
2、卵转铁蛋白具有含量高、活性强等诸多优势。卵转铁蛋白作为在蛋清中含量第二高的蛋白质，是鸡蛋清中一种易溶的非结晶糖蛋白，由686个氨基酸残基组成的单体糖蛋白构成，其中含0.8％的甘露糖，分子量约在70000-78000da之间，等电点约为6.5左右，其结构与乳铁蛋白相近，属于转铁蛋白家族的一员。由于其蛋白质结构中含有两个铁结合位点，因此卵转铁蛋白具有结合并转运铁离子的功能，并具有多种生物活性，如抗菌活性、抗氧化活性、抗病毒活性和免疫调节活性等，在食品和医药领域等领域具有很高的应用潜力。除此之外，与乳铁蛋白相比，卵转铁蛋白在蛋清中的含量是乳铁蛋白在牛奶中含量的140倍，具有非常大的含量优势。因此，高效提取卵转铁蛋白可以为食品蛋白质加工产业提质增效及转型升级提供有力的技术保障，一定程度上解决禽蛋类产品高点配料开发的产业化需求，具有极高的工业应用价值。
3、传统的分离方法仍存在弊端，磁性材料分离具有潜力。国内外对于蛋清中卵转铁蛋白的研究仍不成熟，目前卵转铁蛋白的分离方法主要包括，乙醇提取法、硫酸铵沉淀法、离子交换层析法、超滤纳滤提取、固定化金属螯合亲和色谱法、两步阴离子交换色谱法等方法，普遍存在着产物蛋白易变性、蛋白纯度低、分离效率低下，不适合工业化生产等缺陷。表面修饰磁性纳米颗粒可以使颗粒具有某些特定的功能性质，广泛应用于酶的固定化、食品分析检测、细胞筛选、蛋白质分离等领域。在蛋白质分离领域中，由于蛋白质和功能壳体之间具有特定的吸附作用，磁性纳米颗粒同样表现出良好的分离效果，而且温和的吸附条件也可以有效避免蛋白质的变性，故而可以在外加磁场作用下快速、高效地从复杂的介质体系中分离得到目标蛋白质。然而，目前常见的磁法分离蛋白质的基质主要集中于乳清蛋白或模板蛋白，且主要分离的蛋白质是乳铁蛋白、溶菌酶和牛血红蛋白等，而对于蛋清中的蛋白质，如卵转铁蛋白的分离提取目前并没有应用。因此，研究功能化磁性纳米颗粒对于蛋清中卵转铁蛋白的分离提取，为卵转铁蛋白的高值化应用及高端配料开发提供了一种新策略，并为卵转铁蛋白的工业化生产提供一种可能。
4、目前，磁性纳米颗粒在蛋清中卵转铁蛋白的分离提取的有关应用鲜有报道，具有创新性。与传统的提取方法相比，磁性纳米颗粒用于蛋白分离提取方面具有效率高、耗时短、产物纯、环境友好、功能保护等优势。本发明采用磁性纳米颗粒分离纯化为核心手段，将功能化的磁性纳米颗粒加入至预先处理的上清液中，通过调节蛋清液ph、吸附时间、吸附温度、洗脱ph等条件实现对蛋清卵转铁蛋白的高效分离提取，与之前的提取方法相比，本发明极大程度减少了繁杂的处理步骤，使提取效率大幅提高，并避免了蛋白质的变性。
5、本发明的技术优势主要体现在以下两个方面：
6、第一，本发明是以磁性纳米颗粒分离技术为核心。特别强调的是，将磁性纳米颗粒分离技术应用于蛋清中卵转铁蛋白分离提取的研究中，其技术优势突出体现于：
7、(1)利用伴刀豆球蛋白功能化修饰fe3o4磁性纳米颗粒并加入蛋清中，通过调整蛋清ph、吸附温度、吸附时间等参数，将产物卵转铁蛋白的纯度从50％高到80％以上，对以往的卵转铁蛋白的提取工艺进行了精简和改进。
8、(2)区别于以往卵转铁蛋白的提取常见方法，将磁性纳米颗粒分离技术应用于蛋清中卵转铁蛋白的分离提取，仅需一步吸附分离即可完成提取，且吸附分离不需要额外操作，在0.5～1.5h内即可吸附饱和。与传统的先结合铁再分离铁最后沉淀的繁杂步骤相比，磁法精简了分离步骤，节省了提取时间，提高效率。同时，本发明不同于以往盐沉淀或乙醇沉淀的方案，在保证产率的同时，有效避免了产物卵转铁蛋白的变性，并且通过后期分析也证实产物与卵转铁蛋白标品在结构以及性质上的高度相似性。
9、(3)本发明所合成的fe3o4磁性纳米颗粒在吸附分离后，可以高效回收，在洗脱完成后，磁性纳米颗粒仍能保持其原有吸附效率的90％以上，减少了试剂消耗，对资源利用更加高效。
10、第二，本发明是所采用的磁性纳米颗粒采用化学合成法进行合成，合成所需材料均为常见的fecl3·6h2o、fecl2·4h2o以及氨水，且仅需10～40分钟便可成功合成，具有高效，低成本的显著优势。并且，本实验的蛋清来源为新鲜市场鸡蛋，原料来源广泛且易获取，新鲜鸡蛋也可以保留卵转铁蛋白的理化性质，避免对产物造成影响。
11、本发明与已经授权的《一种从鸡蛋清中提取卵转铁蛋白的方法》(专利号：cn201210254812.x)以及《一种磁性纳米颗粒吸附分离牛血清白蛋白的方法》(专利号：cn201710826685.9)中所申请的权利保护方向有着本质不同。上述2项专利虽然涉及蛋清中卵转铁蛋白的分离提取以及磁性纳米颗粒对蛋白质的吸附分离研究，但前者采用的方法为传统的乙醇沉淀与qsepharoseff阴离子交换层析相结合的方法，该方法需先将卵转铁蛋白结合成铁饱和形式，尽管提高了稳定性，但后续需要繁杂的步骤去除铁，耗时长且效率低下。而后者虽然将磁性纳米颗粒应用于蛋白质分离，但本发明与其有着本质区别，主要体现在：
12、(1)二者的修饰手段有着本质区别：本发明所采用的功能化磁性纳米颗粒采用超声法修饰，步骤简单且易于合成，合成的磁性纳米颗粒具有良好的磁响应性。功能配体为伴刀豆球蛋白a，其与糖蛋白之间有着特异性结合能力，使得卵转铁蛋白迅速结合至功能化纳米粒子表面；而上述发明采用硅烷化修饰，耗时长且效率低下，且氨基硅烷化对目标蛋白并无特异性吸附能力，仅将目标蛋白作为模板蛋白进行吸附分离。
13、(2)二者的目标蛋白有着本质区别：本发明将修饰后磁性纳米颗粒加入至鸡蛋蛋清中，对蛋清中的卵转铁蛋白进行吸附。卵转铁蛋白自身具有抑菌特性，抗氧化特性，抗病毒活性等诸多活性，对卵转铁蛋白的吸附分离对于禽蛋类产品开发具有重要意义；而上述发明的目标蛋白为牛血清白蛋白，是一种等电点为4.7的模式蛋白，常常用于修饰酶、限制酶的保存和反应液中，其广泛应用于遗传工程学研究、医药材料研究等领域，两种蛋白的功能领域和有着本质不同。
14、因此，上述2项专利并不影响本发明专利的创造性与创新性的体现，本发明将伴刀豆球蛋白a功能化fe3o4磁性纳米颗粒并将其应用于蛋清中卵转铁蛋白的吸附研究，是对磁性纳米颗粒应用的拓展；并且以卵转铁蛋白为目标物质，也为今后蛋清中卵转铁蛋白的分离提供了一种高效，绿色，低成本的新思路。
15、本专利的技术优势主要体现在以下4个方面：
16、第一，吸附介质新颖：本发明尝试将功能化修饰的磁性纳米颗粒应用于蛋清中卵转铁蛋白的吸附研究，一方面为今后蛋清蛋白乃至其他基质中蛋白质的分离提取提供了一种可行思路；另一方面，为目前卵转铁蛋白提取方面所存在的问题与缺陷提供了解决措施。同时，本发明有望加快实现卵转铁蛋白功能性配料加入食品中的目标，促进蛋品功能配料的发展。
17、第二，吸附过程简单高效：使用磁性纳米颗粒进行分离提取，吸附过程中不需要额外添加化学物质，有效避免提取出的产物发生变性；同时，与乙醇沉淀法先结合铁再分离铁最后沉淀的繁杂步骤相比，磁性纳米颗粒的吸附过程仅需1步且无需额外添加其他化学物质；与层析法相比，该方法仅需0.5～1.5h即可达到吸附饱和，极大程度节省了提取周期，具有耗时短，效率高，易于操作的优势。
18、第三，成本节约且可循环利用：采用磁性纳米颗粒进行分离提取的另一显著优势是磁性纳米颗粒可以回收利用。对吸附后的纳米颗粒进行充分洗脱后，磁性纳米颗粒的吸附性能仍保持80％～90％，并可以再次利用。而且，合成纳米颗粒所需的fecl3·6h2o、fecl2·4h2o以及氨水均为常见试剂，既降低了合成成本，又有利于环境保护。
19、第四，原料易获取：本发明是以市场新鲜鸡蛋为原料，原料易于获取，且直接从新鲜蛋清中提取也有利于保持卵转铁蛋白原有的特性，提高产物品质。
20、综上所述，纵观国内外相关研究与技术报道，未见将磁性纳米颗粒直接应用于蛋清中卵转铁蛋白的吸附研究。本发明采用超声法修饰fe3o4磁性纳米颗粒并应用于蛋清中卵转铁蛋白的吸附分离研究，得到纯度为90％的卵转铁蛋白，具有创新性。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种以伴刀豆球蛋白修饰的fe3o4磁性纳米颗粒为功能物质，并将其应用于蛋清中卵转铁蛋白分离提取的可行方案。
2、其首先是采用1.5～2.5ml浓度为1.0mg/ml～3.0mg/ml的伴刀豆球蛋白对150mg～300mg磁性纳米颗粒进行修饰，得到功能化磁性纳米颗粒。之后将其加入至预先处理的蛋清上清液中，蛋清ph为5.0～8.0，吸附温度为30～50℃，吸附时间为0.5～3h。吸附完毕后，使用磷酸盐缓冲液对颗粒进行洗脱，收集洗脱液，经脱盐、冻干后得到纯度为80％～90％的卵转铁蛋白。
3、本发明所述的技术方案如下：
4、一种将伴刀豆球蛋白功能化修饰的磁性纳米颗粒应用于鸡蛋蛋清中卵转铁蛋白分离提取的高效方案，其步骤如下：首先将50～250ml新鲜蛋清使用50～250ml蒸馏水进行稀释，并使用1.0％～5.0％的硫酸铵以及1.0％～3.0％的柠檬酸进行初步除杂并复溶后获得上清液。之后使用1.5～2.5ml浓度为1.0mg/ml～3.0mg/ml的伴刀豆球蛋白对150mg～300mg磁性纳米颗粒进行修饰，修饰完毕后加入至预先处理好的上清液中进行吸附，吸附过程在ph 5.0～8.0、温度30～50℃条件下进行0.5～3h。吸附完成后，使用ph 4.0～6.0pbs缓冲液对纳米颗粒进行解吸，解吸时间为0.5～3h。解吸完成后，收集洗脱液，使用10～50kda超滤膜进行脱盐，冻干24～48h后，获得纯度为80％～90％的卵转铁蛋白。
5、具体来说，初步除杂步骤为：使用50～250ml蒸馏水与50～250ml新鲜蛋清进行混合，在0～8℃，150～300rpm条件下磁力搅拌0.5～3.5h。搅拌结束后，将稀释上清液在4～8℃，2000～4000rpm条件下离心10～60min以除去不溶性杂质。离心结束后，收集上清液，在上清液中加入1.0％～5.0％的硫酸铵以及1.0％～3.0％的柠檬酸以初步沉淀卵转铁蛋白粗品。之后在4～8℃，2000～4000rpm条件下离心10～60min以获取粗品卵转铁蛋白。离心结束后，将粗品卵转铁蛋白复溶至ph 7.4～10.0的磷酸盐缓冲液中作为后续的吸附上清液。
6、修饰磁性纳米颗粒的步骤为：每100～400mg的磁性纳米颗粒与10～50ml ph 6.0的磷酸盐缓冲液充分混合后，在额定功率为500～700w的超声功率下超声20～40min形成胶体溶液。随后，将2～10ml浓度为2.0～4.0mg/ml的腈氨溶液加入到胶体溶液中，继续超声20～40min，然后向该溶液中加入0.5～2ml浓度为0.5～2.5mg/ml的伴刀豆球蛋白a溶液，继续超声20～40min，整个超声过程在冰浴上进行。超声结束后，用磁铁在烧杯底部吸附修饰cona后的mnp，去掉反应溶液，用磷酸盐缓冲液对修饰配体con a后的mnp进行清洗后，将其悬浮在磷酸盐缓冲液中，保存备用。
7、吸附和解吸过程，具体来说，将上述制备的纳米颗粒加入至吸附上清液中，在温度30～50℃条件下进行0.5～3h的充分吸附，吸附过程在气浴摇床内进行，摇晃速率为100～200rpm。吸附结束后，用磁铁在烧杯底部吸附磁性纳米颗粒以除去反应上清液。之后将吸附完毕的磁性纳米颗粒加入至ph 4.0～6.0pbs缓冲液中对颗粒进行洗脱0.5～3h，收集洗脱液，使用10～50kda超滤膜进行脱盐，冻干24～48h后获得产物。
8、由上述方案获得纯度在80％～90％的卵转铁蛋白样品，其二级结构与卵转铁蛋白标品的相似度达80％～95％，且每摩尔提取的卵转铁蛋白能结合1.6～2.2摩尔fe3+，与理论值相差不大，保持了较强的铁结合能力。
9、本发明涉及的一种将伴刀豆球蛋白功能化修饰的磁性纳米颗粒应用于鸡蛋蛋清中卵转铁蛋白分离提取的高效方案，为鸡蛋加工以及蛋白质的分离提取提供了可行方案。本发明设计的提取方案耗时短，效率高，可重复，材料易合成，有效避免产物变性，是一种十分有前景的提取方案。