一种CthTerA内含肽变体及其在生物法制备四肽-7中的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学，特别涉及一种cth tera内含肽变体及其在生物法制备四肽-7中的应用。

背景技术：

1、棕榈酰四肽-7(palmitoyl tetrapeptide-7)可以延缓和抑制过量细胞白介素的生成，从而抑制一些不必要或不恰当的炎症反应和糖基化损伤。在体外实验中，研究人员发现在细胞白介素生成时，棕榈酰四肽-7诱导呈现出一种显著的剂量依赖性减少，即棕榈酰四肽-7的使用剂量越高，细胞白介素减少得越多，最高降幅可达到40％。

2、棕榈酰四肽-7具有极高的应用价值。相关技术中，提示了uv紫外线辐射可以促进细胞白介素的生成。当细胞与紫外线辐射接触后，用棕榈酰四肽-7进行治疗，可以看到细胞白介素减少86％。相关技术表明，棕榈酰四肽-7还可以促进结缔组织的生长，增加皮肤中的胶原蛋白的生成。而当胶原蛋白增加的时候，皮肤可以实现自我愈合和再生。此外，棕榈酰四肽-7能加速粒细胞趋化蛋白(gcp-2)表达，促进伤口恢复。而且，棕榈酰四肽-7还是免疫球蛋白igg的片段，而igg有许多生物活性功能，尤其免疫调节功能。棕榈酰四肽-7在美妆产品，尤其是抗衰老产品中有极高的应用前景。相关研究中发现皮肤细胞因子，尤其是il6，参与了慢性炎症反应，在皮肤衰老过程中表现了重要作用。衰老过程中，脱氢表雄酮dhea的下降和il6的增多呈现很强的关联性。而研究发现棕榈酰四肽-7会模拟皮肤中的dhea，从而控制炎性细胞因子在循环系统中的水平，降低老化中il6水平从而达到重新维持皮肤中细胞因子平衡来实现对皮肤的护理，降低炎性反应使皮肤更加紧致、光滑富有弹性。而且棕榈酰四肽-7可以通过充当细胞信使来刺激真皮中胶原纤维的再生，被认为可以增加皮肤中的透明质酸含量，从而可以通过吸引水分至表皮来帮助收紧皮肤。棕榈酰四肽7也常见于抗衰老血清、保湿剂和某些化妆品配方中，经证实其对于皮肤弹性的改善具有显著的统计学意义，且能减少深层皱纹，改善皮肤纹理，并对胶原蛋白1、纤连蛋白和透明质酸合成具有剂量反应。因此，棕榈酰四肽-7及其中间体四肽-7具有重要的市场应用价值。

3、然而，目前关于四肽-7的工业化合成主要依赖于化学合成，这种合成方法副产物多、产率低、污染大、成本高，难以符合“碳中和”的时代需求。生物合成虽然能够有效解决化学合成的缺陷，但对于复杂结构的四肽-7，目前尚未有高效的生物合成途径。而且，目前基于化学合成得到的四肽-7的过程中往往会带来很多合成副产物，有些副产物甚至具有较大的细胞毒性，从而使得四肽-7的生产和提纯消耗大量的成本，且容易带来严重的污染，极大地限制了四肽-7的进一步开发与应用。因此，开发一种更加绿色经济且高效的合成方式，是四肽-7工业化生产所急需的。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提出一种内含肽及其在生物法制备四肽-7中的应用，通过该内含肽与四肽-7的融合，能够高效且规模化生产高纯度四肽-7，有效避免了副产物和有毒有害物质的产生。

2、本发明的第一个方面，提供一种cth tera内含肽变体，所述cth tera内含肽变体的氨基酸序列如seq id no:3所示。

3、在本发明中，所述cth tera内含肽变体是基于cth tera内含肽原始序列进定向化改造得到的。

4、在本发明的一些实施方式中，所述cth tera内含肽原始序列为clostridiumthermocellum atcc27405的tera基因片段。

5、在本发明的一些实施方式中，所述tera基因片段选自genbank:wp_127837222.1中第68-400位氨基酸残基片段中的片段。

6、本发明的第二个方面，提供编码本发明第一个方面所述cth tera内含肽变体的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no:4所示。

7、在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子还包括与seq id no:4具有85％、90％、95％或以上同一性且具有同样自切割活性的序列。

8、在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子还包括与seq id no:4具有95％、96％、97％、98％或99％同一性且具有同样自切割活性的序列。

9、本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述的cth tera内含肽变体作为标签序列在蛋白纯化中的应用。

10、在本发明中，发明人发现经过定向化改造后的cth tera内含肽变体相比与cthtera内含肽原始序列具有更强的自切割活性，从而实现更高的自切割效果。

11、本发明的第四个方面，提供一种蛋白纯化产品，所述蛋白纯化产品包括如下(1)～(4)中的至少一种：

12、(1)本发明第一个方面所述的cth tera内含肽变体；

13、(2)本发明第二个方面所述的核酸分子；

14、(3)含有(2)中核酸分子的表达盒；

15、含有(2)中核酸分子或含有(3)中表达盒的转化子；

16、其中，所述转化子包括病毒、细菌、真菌和细胞。

17、在本发明的一些实施方式中，所述转化子为细菌。

18、在本发明的一些实施方式中，所述转化子为大肠杆菌。

19、本发明的第五个方面，提供一种融合蛋白，所述融合蛋白中含有权利要求1中所述的cth tera内含肽变体序列和四肽-7序列。

20、在本发明的一些实施方式中，所述四肽-7为gqpr。

21、在本发明的一些实施方式中，所述融合蛋白中还含有修饰序列。

22、在本发明的一些实施方式中，所述修饰序列包括但不限于his标签序列、gst标签序列、flag标签序列、halo标签序列、ha标签序列、myc标签序列、snap标签序列中的至少一种。

23、在本发明的一些实施方式中，所述修饰序列为his标签序列。

24、在本发明的一些实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如seq id no:5所示。

25、在本发明的一些实施方式中，所述融合蛋白的核苷酸序列如seq id no:6所示。

26、本发明的第六个方面，提供本发明第五个方面所述的融合蛋白在制备四肽-7中的应用。

27、在本发明中，发明人基于编码该融合蛋白的核苷酸序列构建得到了表达带有cthtera内含肽变体标签的四肽-7，从而实现了不使用化学物质和酶得到高纯度四肽-7的技术效果。

28、本发明的第七个方面，提供一种四肽-7前体物质，所述四肽-7前体物质包括如下(5)～(8)中的至少一种：

29、(5)本发明第五个方面所述的融合蛋白；

30、(6)编码(5)中融合蛋白的核酸分子；

31、(7)含有(6)中核酸分子的表达盒；

32、(8)含有(6)中核酸分子或含有(7)中表达盒的转化子；

33、所述转化子包括病毒、细菌、真菌和细胞。

34、在本发明的一些实施方式中，所述转化子为细菌。

35、在本发明的一些实施方式中，所述转化子为大肠杆菌。

36、本发明的第八个方面，提供一种生物法制备四肽-7的方法，包括如下步骤：

37、连接本发明第一个方面中所述的cth tera内含肽变体序列和四肽-7序列，将其插入质粒载体中，转染至转化子中，诱导剂诱导蛋白表达，破碎细胞后收集上清，在层析柱中进行自切割，收集流通液即得四肽-7。

38、在本发明的一些实施方式中，所述四肽-7为gqpr。

39、在本发明的一些实施方式中，所述cth tera内含肽变体序列连接于四肽-7序列的c端。

40、在本发明的一些实施方式中，通过双酶切法将cth tera内含肽变体-四肽-7融合序列酶切片段通过dna连接酶插入于质粒载体中。

41、在本发明的一些实施方式中，所述dna连接酶为t4 dna连接酶。

42、当然，本领域技术人员也可以采用其他基因编辑手段将cth tera内含肽变体-四肽-7融合序列插入于质粒载体中，以实现特定载体的构建。

43、在本发明的一些实施方式中，构建得到的质粒载体的核苷酸序列如seq id no:7所示。在本发明中，发明人发现本发明中的内含肽cth tera-四肽-7表达载体具有高表达内含肽cth tera-四肽-7融合蛋白的效果，且其能够基于内含肽cth tera快速去除各种标签，从而获得可直接作为原材料使用的无修饰四肽-7。

44、在本发明的一些实施方式中，在转染至转化子中后进行阳性克隆的筛选。

45、在本发明的一些实施方式中，所述筛选采用卡那霉素抗性平板进行筛选。

46、在本发明的一些实施方式中，所述层析柱为ni-nta亲和层析柱。

47、在本发明的一些实施方式中，所述自切割的具体操作为：向ni-nta亲和层析柱中再加入缓冲液，混匀后室温孵育过夜。

48、在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液包括但不限于磷酸缓冲液。

49、在本发明的一些实施方式中，所述步骤还包括对流通液和洗脱液进行浓缩、干燥。

50、在本发明中，发明人发现基于上述方法可以高效地获得高纯度、无修饰的四肽-7，其纯度高达85％以上。

51、四肽-7是四个氨基酸组成的寡肽，氨基酸序列为gqpr。发明人发现，通过利用天然生物系统中“中心法则”里的mrna翻译成多肽链，其能有序的按照基因编码信息实现氨基酸添加，使得四肽-7可以通过体外制备好的遗传信息转入到细胞系统中获得稳定表达该遗传信息产物的工程生命体表达得到。从而在技术角度上相比化学合成具有至少以下优势：1)操作简单，只要构建出表达特定肽类的工程菌，就可以持续的进行肽类的表达；2)成本低，底物都是一些最基础的营养物质，不需要昂贵的材料；3)副产物少，提纯容易，基本没有合成副产物，只有生命体代谢的产物，容易分离和提纯；4)清洁环保，几乎无污染，符合“碳中和”的时代需求；5)效率高，合成效率高效，可以大规模生产和获得。因此，可以看出，本发明中的相关应用相较于化学合成具有显著的技术优势。但现有技术中的问题在于没有四肽-7生物合成的案例，这是因为四肽-7肽链太短，难以在生物培养物中检测和分离。虽然有方法提及可以利用包含蛋白酶切割位点的寡肽融合蛋白来提高寡肽的肽链的长度，使其易于在表达过程中检测寡肽的产量，并利用亲和标签来降低寡肽的纯化难度。但这种办法需要在蛋白纯化后引入额外的蛋白内切酶来进行寡肽的释放和分离。这增加了寡肽的生产复杂程度，降低了寡肽的产能。同时还容易引入额外的氨基酸残基，导致寡肽的性能或功能改变。而本发明中的内含肽能够有效地解决上述问题。内含肽是一类能够通过自催化完成切割的氨基酸序列，其能够在特定的条件完成自身和蛋白之间的分离。而本发明中的内含肽能够针对四肽-7实现定向切割，实现特定蛋白上各类蛋白标签的有效去除。

52、本发明的有益效果是：

53、1.本发明中提供了一种新的cth tera内含肽变体序列，通过将其与四肽-7组成融合蛋白，在导入载体质粒后制备得到高效、稳定的四肽-7的重组表达载体，在转入细菌得到工程菌后，通过诱导表达能够获得高纯度的无修饰四肽-7。

54、2.本发明中的四肽-7是基于内含肽cth tera-四肽-7重组表达载体得到的，其制备方法简单，仅需经过细胞破碎、内含肽切割等简单的步骤，就可以高效地获得高纯度的四肽-7，且生物合成方法能够有效降低污染和有毒有害副产物的产生，产出量大，适用于四肽-7的大规模工业化量产，从而获得高品质的四肽-7，具有较大的市场价值。